抗髓過氧化物酶及乳鐵蛋白抗體對自身免疫性肝炎檢測的臨床研究①

譚立明 張玉紅 陳冬蓮 明 鳳 李 華 陳娟娟 王外梅 熊金旺

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌330006)

自身免疫性肝炎(Autoimmune hepatitis，AIH)是一組典型組織學(xué)表現(xiàn)為界面性肝炎(碎屑樣壞死)、血清轉(zhuǎn)氨酶升高、高球蛋白血癥、自身抗體檢測呈陽性、病毒指標(biāo)呈陰性的慢性炎癥，可合并肝外自身免疫性疾?。?，2］?，F(xiàn)多認(rèn)為由免疫遺傳背景加上環(huán)境因素刺激引起免疫耐受缺陷和體內(nèi)免疫微環(huán)境平衡紊亂而導(dǎo)致的以自身肝細(xì)胞為靶抗原的自身攻擊現(xiàn)象［3，4］，發(fā)病機(jī)制尚不明確。本研究通過檢測 AIH與非AIH患者血清中抗髓過氧化物酶抗體(Antimyeloperoxidase antibody，AMPA)、抗乳鐵蛋白抗體(Anti-lactoferrin antibody，ALA)等自身抗體，探討AMPA、ALA等自身抗體對AIH檢測的臨床意義，旨在發(fā)現(xiàn)潛在血清學(xué)指標(biāo)，提高AIH的診斷水平以及為進(jìn)一步研究AIH發(fā)病機(jī)理提供依據(jù)，研究報(bào)告分析如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 63例AIH及206例非AIH患者來自南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院自2008年7月至2012年6月門診、住院確診病例。63例AIH患者中男性9例，女性54例，年齡為4～69歲，平均為43歲;206例非AIH分別為:36例原發(fā)性膽汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)中男性6例，女性30例，年齡為31～69歲，平均為49歲，25例原發(fā)性硬化性膽管炎(Primary sclerosing cholangitis，PSC)中男性19例，女性6例，年齡為21～61歲，平均為39歲;61例乙型肝炎(Hepatitis B，HB)中男性29例，女性32例，年齡為18～60歲，平均為38歲，53例丙型肝炎(Hepatitis C，HC)中男性27例，女性26例，年齡為20～59歲，平均為41歲，31例戊型肝炎(Hepatitis E，HE)中男性11例，女性20例，年齡為18～60歲，平均年齡為47歲;對照組50例均為南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢中心健康體檢者，男性15例，女性35例，年齡為23～57歲，平均年齡為33歲。均獲得患者以及證明為無病健康體檢者的許可，所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 診斷依據(jù) ①自身免疫性肝病AIH、PBC、PSC診斷綜合參考國際診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］;②病毒性肝炎診斷參考衛(wèi)生部2008年更新的病毒性肝炎診斷指南［6］。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 2007年7月至2012年6月在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院確診的AIH及非AIH患者，自愿成為研究對象且符合以下條件者予以納入:①臨床資料齊全且具有肝組織學(xué)病理資料;②自身免疫性肝病患者至少兩次檢測病毒性標(biāo)志物為陰性;③對所有自愿參與病人的資料重新評估，無血色病、抗胰蛋白酶缺乏癥、Wilson病等其他遺傳性肝損疾病;④年齡在4～70歲，均符合本研究參考的診斷指標(biāo)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 凡有下列情況者予以剔除:①?zèng)]有完整臨床資料或肝組織學(xué)病理資料;②發(fā)病前有明確服用肝毒性藥物史，酒精性脂肪肝病史，大量飲酒史，惡性腫瘤史;③患有血色病、抗胰蛋白酶缺乏癥、Wilson病等其他遺傳性肝損疾病;④合并糖尿病、痛風(fēng)、苯丙酮尿癥;⑤妊娠或哺乳期婦女;⑥失代償期肝硬化;⑦不愿成為研究對象。

1.5 試劑和方法

1.5.1 標(biāo)本的采集 標(biāo)本均為空腹采集不抗凝血2.0 ～3.0 ml，以2 500 r/min 速度離心15 分鐘分離血清，－20℃冷凍待檢。

1.5.2 檢測方法 AMPA、ALA檢測采用德國歐蒙公司生產(chǎn)的ELISA法試劑，操作過程為將樣品稀釋，按加樣方案向相應(yīng)微孔中分別加稀釋血清、陰性、陽性對照和空白對照各100 μl，室溫溫育30分鐘，洗板3次，加酶標(biāo)抗體100 μl再室溫溫育30分鐘，同前洗板3次。加底物顯色，5分鐘后加終止液，用450 nm波長比色，計(jì)算結(jié)果?？购丝贵w(Anti-nuclear antibodies，ANA)、抗平滑肌抗體(Antismooth muscle antibodies，ASMA)、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(Anti-neutropil cytoplasmic antibodies，ANCA)檢測的試劑盒由德國歐蒙公司生產(chǎn)，ANA選擇Hep-2細(xì)胞和猴肝作為抗原;ASMA抗體采用大鼠胃的冰凍組織切片;ANCA采用在生物薄片馬賽克上覆有中性粒細(xì)胞(乙醇或甲醛固定)、Hep-2細(xì)胞和猴肝四種基質(zhì)的復(fù)合片，4℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用完全空白對照，操作方法嚴(yán)格按試劑說明及科室作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)描述，組間單因素分析采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并對AIH患者各種自身抗體的敏感性、特異性、有效性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比和陰性似然比等指標(biāo)進(jìn)行臨床評價(jià)，有效性=(真陽性+真陰性)/(病例組+對照組);特異性=真陰性/對照組;敏感性=真陽性/病例組;陽性預(yù)測值=真陽性/陽性組;陰性預(yù)測值=真陰性/陰性組;陽性似然比=真陽性率/假陽性率;陰性似然比=假陰性率/真陰性率。

2 結(jié)果

2.1 AIH與非AIH對AMPA、ALA等自身抗體的檢測 63例AIH、206例非AIH及50例健康體檢者檢測AMPA、ALA、ANCA、ASMA及ANA結(jié)果顯示，AIH組AMPA陽性率為61.9%(39/63)，與非AIH及對照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01;AIH組ALA陽性率為19.0%(12/39)，非 AIH組陽性率0.5%(1/206)，組間比較 P＜0.01，PSC 組有1例陽性(4.0%)，與 AIH 組比較 P＞0.05;ASMA 陽性率最高為68.3%，ANA陽性各組均有檢出，與非AIH各組比較均P＜0.05，詳見表1。

2.2 AIH患者AMPA、ALA等自身抗體檢測的各項(xiàng)試驗(yàn)評價(jià)指標(biāo) AMPA、ALA、ANCA、ASMA及ANA在AIH患者中各項(xiàng)臨床試驗(yàn)指標(biāo)顯示ALA、AMPA特異性分別高達(dá)99.61%、97.2%，但敏感性ALA最低為19.05%，詳見表2。

表1 AIH 及非AIH 患者AMPA、ALA、ANCA、ASMA和ANA檢測結(jié)果［例(%)］Tab.1 AIH and non AIH patient’s results in detected by AMPA，ALA，ANCA，ASMA and ANA［n(%)］

表2 AMPA、ALA、ANCA、ASMA及ANA在AIH患者臨床評價(jià)指標(biāo)比較Tab.2 The clinical indexes of AMPA，ALA，ANCA，ASMA and ANA in AIH

表3 AIH各亞型患者AMPA、ALA、ANCA、ASMA和ANA陽性結(jié)果［例(%)］Tab.3 Different subtypes of AIH patient’s results in detection of AMPA，ALA，ANCA，ASMA and ANA positive results［n(%)］

表4 AMPA、ALA、ANCA、ASMA 及 ANA 在 AIH-Ⅰ患者臨床評價(jià)指標(biāo)比較Tab.4 The clinical indexes of AMPA，ALA，ANCA，ASMA and ANA in AIH-Ⅰ

2.3 AIH各亞型患者AMPA、ALA等自身抗體的檢測 AIH患者AIH-Ⅰ組AMPA陽性率73.6%(39/53)，AIH-Ⅱ組AMPA陽性為零，組間比較P＜0.01;AIH-Ⅰ組 ALA 陽性率 20.8%(11/53)，AIH-Ⅱ組ALA陽性率 10.0%(1/10)，組間比較 P＞0.05;AIH-Ⅰ組檢測ANCA陽性率77.4%(41/53)，ASMA陽性率75.5%(40/53)，ANA陽性率71.7%(38/53)，與AIH-Ⅱ組間比較均P＜0.01。相關(guān)性分析，經(jīng) χ2檢驗(yàn)，AIH-Ⅰ型中 AMPA 與 ANCA、ASMA、ANA比較，均為P＜0.01，ALA與各抗體比較均P＞0.05;AIH-Ⅱ組 ALA 與 AMPA、ANCA、ANA 比較均為 P ＜0.05，與 ASMA 比較 P ＞0.05，詳見表3。

2.4 AIH-Ⅰ中AMPA、ALA等自身抗體檢測的各項(xiàng)試驗(yàn)評價(jià)指標(biāo) AMPA、ALA、ANCA、ASMA及ANA在AIH-Ⅰ患者中各項(xiàng)臨床試驗(yàn)指標(biāo)顯示特異性AMPA、ANCA均最高為100%，ALA為98.33%，但ALA敏感性最低為20.75%，陽性預(yù)測值 AMPA、ANCA均最高為100%，ALA為91.67%，陽性似然比AMPA、ANCA均最大，詳見表4。

3 討論

隨著免疫學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)等臨床診斷水平的不斷提高，AIH的診斷已不再罕見，該病多發(fā)于女性［3］，免疫抑制劑治療通常有一定療效，但嚴(yán)重病例若不及時(shí)治療六個(gè)月死亡率將高達(dá)40%。與其他肝病相比AIH無明顯特異性而常導(dǎo)致誤診［7］，等確診接受正確治療時(shí)已發(fā)展為肝硬化。AIH患者體內(nèi)產(chǎn)生各種自身抗體，ANCA就是其中一種，髓過氧化物酶 (Myeloperoxidase，MPO)、乳鐵蛋白 (Lactoferrin，LF)均為ANCA的靶抗原。MPO是血管中活化的中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌的血紅素蛋白酶，近年來研究發(fā)現(xiàn)MPO基因的多態(tài)性與多種疾病的易感性有關(guān)［8］，表明中性粒細(xì)胞活化后聚集至腎臟并大量釋放 MPO［9，10］，認(rèn)為 AMPA 與腎臟損傷改變密切相關(guān)，AMPA是否同樣與AIH患者肝臟受損密切相關(guān)呢?在急性炎癥疾病時(shí)，ALA水平會(huì)增高。研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞中的一些顆粒蛋白(除蛋白酶-3和MPO)相應(yīng)的自身抗體可作為潛在的血清自身抗體指標(biāo)，如ALA［11］。自身抗體的產(chǎn)生是AIH的特點(diǎn)之一，因此，找到更多具有高敏感性或疾病特異性的血清自身抗體對AIH的診斷與鑒別有重要意義。

筆者對63例AIH患者檢測血清AMPA、ANCA、ASMA及ANA等自身抗體，陽性率分別為61.9%、65.1%、68.3%、60.3%，結(jié)果與報(bào)道相符［12，13］，與非 AIH相比，P＜0.01;AIH中 ALA陽性率為19.05%，與非AIH比較P＜0.01，且非AIH組中僅發(fā)現(xiàn)PSC中有1例ALA陽性，其余均為陰性，并且AIH各項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)顯示特異性為ALA最高99.6%，AMPA為97.27%，ASMA除特異性與陰性似然比均最高，ANA檢測在AIH組陽性率60.3%，PBC組陽性率33.3%，PSC組陽性率32.0%，HCV組陽性率為24.5%，HBV陽性率為 9.8%，HEV陽性率為9.7%;ASMA檢測在AIH組陽性率為68.3%，PBC組陽性率為5.6%，其余組為零，與王愛莉等人的報(bào)道基本一致［14-16］?？贵w間相關(guān)性分析，經(jīng)χ2檢驗(yàn):AIH組，AMPA與ANCA、ASMA比較均為P＜0.05，ALA與其余抗體比較為P＞0.05;AIH-Ⅰ組，AMPA與ANCA、ASMA、ANA 比較均為P ＜0.01，ALA 與各抗體比較P＞0.05。說明AMPA診斷AIH的價(jià)值優(yōu)于ANCA、ASMA，ALA的診斷價(jià)值與NCA、ASMA及ANA相當(dāng)，AMPA鑒別AIH-Ⅰ有非常顯著性意義，AMPA、ALA聯(lián)合 ANCA、ASMA及 ANA抗體檢測對AIH的鑒別診斷有重要意義，AMPA及ALA等自身抗體與AIH的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

ANCA是以中性粒細(xì)胞胞質(zhì)為靶抗原的自身抗體，分為核周型抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(p-ANCA)和核質(zhì)型抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體(c-ANCA)。p-ANCA的靶抗原主要是MPO，MPO為中性粒細(xì)胞功能與活化的標(biāo)志，MPO不但能殺滅細(xì)胞內(nèi)的微生物還能釋放到細(xì)胞外，破壞多種靶物質(zhì)，在機(jī)體調(diào)節(jié)和產(chǎn)生炎癥反應(yīng)等諸多方面發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，p-ANCA與MPO結(jié)合后，MPO功能受到抑制，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞大量活化，呼吸爆炸，脫顆粒，產(chǎn)生大量過氧化物和超氧化物，致使炎癥組織細(xì)胞損害;p-ANCA也可通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞使E-選擇素、血管黏附分子-1及細(xì)胞間黏附分子-1等黏附分子的表達(dá)增加，從而干擾MPO抑制物血漿銅藍(lán)蛋白的滅活，引起組織損傷。AIH發(fā)病機(jī)制尚不明確，AMPA是否與AIH存在相關(guān)性呢?筆者檢測63例AIH患者血清AMPA抗體陽性率為69.1%，與非AIH各組比較，P＜0.01，差異有非常顯著性意義;AIH亞型AIH-Ⅰ AMPA陽性率為73.6%，而 AIH-Ⅱ及健康組AMPA均無1例陽性，與文獻(xiàn)［17］報(bào)道基本一致，說明AMPA與AIH特別是與AIH-Ⅰ有密切關(guān)系，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

LF是由中性粒細(xì)胞顆粒釋放的一種鐵結(jié)合糖蛋白［18］，存在鼻腔分泌物、唾液、眼淚、初乳、陰道分泌物、精液等體液中，是人體免疫系統(tǒng)第一道戰(zhàn)線上的勇士［19］，研究發(fā)現(xiàn) LF有特異的免疫調(diào)節(jié)功能［16-20］，主要與其靶細(xì)胞表面的特異性受體有關(guān)，單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板、肝細(xì)胞、乳腺表皮細(xì)胞及腸上皮細(xì)胞的表面均發(fā)現(xiàn)有LF受體［21］，LF能與細(xì)胞表面受體結(jié)合從而發(fā)揮免疫功能;LF與脂多糖(LPS)有很高的親和力［22］，可以和LPS-結(jié)合蛋白競爭性結(jié)合LPS，從而阻止LPS向單核細(xì)胞表面的補(bǔ)體CD14傳遞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，LF還能抑制炎癥區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)IL-8的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，調(diào)節(jié)白細(xì)胞在炎癥區(qū)的聚集，抑制毒血癥的發(fā)生。總之，LF具有促進(jìn)中性粒細(xì)胞吸附聚集于炎癥部位、增加粒細(xì)胞黏附作用、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫球蛋白分泌、抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的激活或激活已有的補(bǔ)體、參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫耐受能力以及促進(jìn)細(xì)胞間相互作用等一系列功能［23，24］。筆者假設(shè)中性粒細(xì)胞被激活，脫顆粒從而釋放LF，與肝細(xì)胞表面的LF受體結(jié)合，同時(shí)大量中性粒細(xì)胞聚集，機(jī)體免疫耐受能力下降，導(dǎo)致ALA攻擊肝細(xì)胞從而導(dǎo)致肝損傷。筆者檢測63例AIH與206例非AIH患者血清中ALA陽性率分別為19.0%，0.5%，經(jīng) χ2檢驗(yàn)，P ＜0.01，差異有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而非AIH中僅僅PSC組中檢出1例ALA陽性，其余組ALA檢測均為陰性，AIH各項(xiàng)臨床評價(jià)指標(biāo)顯示ALA特異性為最高達(dá)99.61%，有效性為83.70%，陽性預(yù)測值為92.31%，陰性預(yù)測值為83.33%，但在其他指標(biāo)評價(jià)均很高的情況下，ALA的敏感性卻最低僅為19.05%，充分證明ALA的檢測對診斷AIH有非常高的特異性，優(yōu)于在其他自身免疫性肝病。

最新研究表明根據(jù)血清自身抗體可以將AIH分為兩種亞型，AIH-Ⅰ最常見，以ANA和(或)ASMA陽性為主要特征;AIH-Ⅱ多見于兒童，也可伴ANA和(或)ASMA陽性［3］。本研究結(jié)果顯示AM-PA檢測在 AIH-Ⅰ患者中陽性率73.6%，和文獻(xiàn)［25］報(bào)道相符，與AIH-Ⅰ和健康對照組比較P＜0.01，差異有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AIH-Ⅰ組經(jīng)檢測ALA陽性率20.8%，與健康組比較P＜0.05，差異有顯著性意義;AIH-Ⅰ各項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)顯示特異性為AMPA、ANCA最高100%，ALA為98.33%，陽性預(yù)測值A(chǔ)MPA、ANCA最高100%，同樣ALA敏感性最低為20.75%，AIH各項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)顯示除特異性和陰性似然比外均為ASMA最高，敏感性68.25%，有效性93.10%，陽性預(yù)測值95.5%，陰性預(yù)測值92.70%，陽性似然比 87.37。所以 AMPA、ALA 聯(lián)合ANCA、ASMA及ANA等自身抗體檢測對AIH亞型的鑒別診斷有一定價(jià)值。

某些藥物引起的肝損害患者常能檢測到自身抗體陽性，如抗ANA、ASMA等抗體，臨床表現(xiàn)為慢性肝炎癥狀、發(fā)熱、高球蛋白血癥、關(guān)節(jié)疼痛等慢性肝病體征，同樣主要為女性患者，與AIH很難鑒別，近年來極受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。Bjornsson等［26］發(fā)現(xiàn)藥物誘導(dǎo)的AIH與經(jīng)典AIH在自身抗體、肝功能指標(biāo)、免疫球蛋白、組織學(xué)、性別以及年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，導(dǎo)致誤診誤療。也有研究表示病毒感染也會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生自身免疫現(xiàn)象，與自身免疫性肝炎可出現(xiàn)類型相似的自身抗體［27，28］，常導(dǎo)致誤診。本研究顯示，ALA檢測AIH組陽性率19.0%，非AIH組陽性率 0.5%，經(jīng) χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05，差異有顯著性意義，非AIH組中僅僅PSC組發(fā)現(xiàn)1例陽性，這表明ALA聯(lián)合原始血清自身抗體檢測對鑒別診斷AIH與非AIH有非常重要的價(jià)值，可能是鑒別AIH和藥物性自身免疫性肝炎(DIAIH)或者其它自身免疫性疾病以及病毒性肝炎的潛在武器。

綜上所述，AMPA、ALA與 AIH有一定的相關(guān)性，是診斷AIH的有效血清學(xué)自身抗體檢測指標(biāo)，聯(lián)合ANCA、ASMA及ANA等自身抗體的檢測對AIH的診斷與鑒別診斷有重要意義。AMPA、ALA與AIH有密切關(guān)聯(lián)，內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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