非洲豬瘟病毒VP73蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與間接ELISA方法的建立

曾少靈，廖立珊，唐金明，楊俊興，阮周曦，張彩虹，曹琛福，呂建強(qiáng)，秦智鋒，林慶燕，孫 潔，葉弈優(yōu)，謝曉露，花群義＊

（1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳518045；2.深圳市外來有害生物檢測(cè)技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518045）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的豬的一種急性、高度接觸傳染性疾病。ASFV是一種蟲媒性DNA病毒，僅有一個(gè)血清型，但有多個(gè)毒力差別的病毒株［1］。非洲豬瘟臨床癥狀是高熱、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官嚴(yán)重出血、呼吸障礙、神經(jīng)癥狀，病程短，病死率高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害很大，可造成毀滅性的嚴(yán)重后果，受到世界各國的高度重視［1］。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，在我國則列為一類動(dòng)物疫?。?］。

1921年，ASF在肯尼亞被首次發(fā)現(xiàn)，此后在非洲、歐洲和美洲等地的數(shù)10個(gè)國家發(fā)生和流行，由于非洲國家部分地區(qū)的社會(huì)動(dòng)亂和缺少疫病上報(bào)制度，目前ASF流行的實(shí)際狀況比上報(bào)的信息可能要嚴(yán)重得多［1-3］。OIE疫情公告中，俄羅斯自2011年以來幾乎每個(gè)月均有暴發(fā)ASF疫情，每次暴發(fā)均導(dǎo)致上萬頭豬死亡或被撲殺，對(duì)豬養(yǎng)殖業(yè)造成了重大損失［4-5］，同時(shí)對(duì)包括我國在內(nèi)的與其接壤的周邊國家和地區(qū)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，對(duì)我國防控ASF的傳入敲響了警鐘［6］。

ASFV VP73基因全長1 188bp，編碼的VP73蛋白是ASFV的主要抗原性結(jié)構(gòu)蛋白，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，且抗原性極為穩(wěn)定，目前常被用作ELISA和Western blot檢測(cè)ASFV血清抗體的主要抗原［1］。我國目前未發(fā)現(xiàn)ASF，作為防控監(jiān)測(cè)使用的商業(yè)檢測(cè)試劑盒基本上需從國外引進(jìn)，檢測(cè)技術(shù)依賴國外，檢測(cè)成本昂貴，試劑購置周期長，一定程度上限制了我國監(jiān)測(cè)ASF的力度和效果。本研究在昆蟲細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了VP73蛋白的真核表達(dá)，獲得了免疫原性良好的重組蛋白，為ASF的免疫血清學(xué)診斷試劑制備及監(jiān)測(cè)技術(shù)儲(chǔ)備奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸埃希菌（E.coli）DH5α、DH10Bac和載體pFastBac HTA、pFastBac HTCAT均為Invitrogen公司產(chǎn)品；載體pMD18-T為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pBAD-VP73（含ASFV全長VP73基因，大小1 188bp）和昆蟲細(xì)胞Sf9均為深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 非洲豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清由英國動(dòng)物衛(wèi)生研究所（IAH）Pribright實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒（2型）病和豬細(xì)小病毒病等豬陽性血清均為深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存；各種酶、核酸提取試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司；Cellfectin○RⅡ Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒、InVisionTM His-tag In-gel Stain蛋白膠染色試劑盒、抗豬IgG-HRP、Sf-900ⅡSFM培養(yǎng)基等購自Invitrogen公司；引物合成、DNA測(cè)序由Invitrogen公司完成。

1.1.3 儀器 ABI Veriti 96well Thermal Cycler型PCR儀，BioRad Universal HoodⅡ凝膠成像儀，Eppendorf 5415R型高速離心機(jī)，CTC-256型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，MA100型核酸／蛋白計(jì)數(shù)儀，I MARK型自動(dòng)酶標(biāo)儀等。

1.2 方法

1.2.1 重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac HTA-VP73的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中ASFV VP73基因序列，設(shè)計(jì)引物 primer F（EcoRⅠ）5′-G GAATTC ATGGCATCAGGAGGAG-3′和 primer R（PstⅠ）5′-A CTGCAG TTATGGTTTAAAGCGTAT-3′，擴(kuò)增pBAD-VP73質(zhì)粒中的全長VP73基因，將擴(kuò)增片段克隆至pMD18-T，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，37℃培養(yǎng)16h，挑取陽性菌落，提取重組轉(zhuǎn)座載體pMD18TVP73ZH送公司測(cè)序。通過EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切，將擴(kuò)增片段從pMD18T-VP73ZH質(zhì)粒中切出并定向插入轉(zhuǎn)座載體pFastBac HTA，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，37℃培養(yǎng)24h，挑取陽性菌落，提取重組質(zhì)粒pFastBac HTA-VP73，以酶切和PCR方法進(jìn)行鑒定。

1.2.2 重組表達(dá)載體Bacmid-VP73的構(gòu)建 將重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac HTA-VP73轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac，涂于含 X-gal、IPTG、慶大霉素、卡那霉素和四環(huán)素的篩選平板上，37℃培養(yǎng)48h，挑取白色菌落。同時(shí)將pFastBac HT-CAT和pFastBac HTA進(jìn)行上述操作，分別作為陽性和陰性對(duì)照。提取重組Bacmid DNA （Bacmid-VP73、Bacmid-pFast-Bac HT-CAT 和 Bacmid-pFastBac HTA），使 用Bac-to-Bac Baculovirus Expression System操作手冊(cè)推 薦 的 引 物 （pUC／M13Forward：5′-CCCAG TCACG ACGTT GTAAA ACG-3′，pUC／M13Reverse：5′-AGCGG ATAAC AATTT CACAC AGG-3′）進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.3 重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞Bacmid-vp73、Bacmid-pFastBac HT-CAT 和 Bacmid-pFastBac HTA經(jīng)脂質(zhì)體化處理后，分別轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞空白對(duì)照，28℃培養(yǎng)3d，收集培養(yǎng)上清（含有重組桿狀病毒）。上清物再感染正常Sf9細(xì)胞，通過顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，一般36h～48h內(nèi)出現(xiàn)病變現(xiàn)象，至大約72h有超過80%的細(xì)胞發(fā)生明顯病變，此時(shí)收集細(xì)胞。

1.2.4 SDS-PAGE和Western blot檢測(cè) 分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，確定表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中的存在形式。分別以六組氨酸抗體和非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)血清抗體對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot檢測(cè)，確定目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)情況和抗原性。

1.2.5 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）的建立經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)確定表達(dá)產(chǎn)物主要存在于細(xì)胞內(nèi)。以pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）懸浮清洗細(xì)胞，4 000r／min離心10min收集細(xì)胞。重復(fù)清洗1次～2次。以ELISA包被液重新懸浮細(xì)胞，反復(fù)凍融3次～5次后，以ELISA包被液稀釋成不同濃度的裂解液，以核酸／蛋白計(jì)數(shù)儀測(cè)定裂解液中的蛋白濃度。分別取50μL裂解液包被ELISA板，4℃過夜。用洗液清洗1次，封閉液37℃封閉2h，清洗2次，備用。分別對(duì)ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清按1∶100、1∶200、1∶400和1∶800進(jìn)行稀釋，與豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒（2型）病和豬細(xì)小病毒病等豬陽性血清一起作為待測(cè)樣品，采用包被好的ELISA板進(jìn)行ASFV血清抗體的iELISA檢測(cè)。加入各種血清樣品后，37℃孵育45min，洗板4次，加入羊抗豬IgG為二抗，37℃孵育30min，顯色，測(cè)定OD450nm值。

2 結(jié)果

2.1 ASFV VP73基因的擴(kuò)增與重組質(zhì)粒pMD18T-VP73ZH的鑒定

從pBAD-VP73重組質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得全長VP73基因，上下游分別含有EcoRⅠ和PstⅠ酶切位點(diǎn)，將片段克隆至pMD18-T質(zhì)粒中。對(duì)重組質(zhì)粒pMD18T-vp73ZH進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明含有ASFV VP73基因的完整讀碼框，基因上下游兩端帶有EcoRⅠ和PstⅠ酶切識(shí)別序列。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，可見大小約1 200bp的特異性條帶，大小與預(yù)期相符（圖1）。

2.2 重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac HTA-VP73的鑒定

采用EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切定位插入的方式，將目標(biāo)片段從pMD18T-VP73ZH重組質(zhì)粒中切出并定向定點(diǎn)插入載體pFastBac HTA的強(qiáng)啟動(dòng)子下游，保證了插入基因的堿基精確對(duì)框，在表達(dá)時(shí)不發(fā)生錯(cuò)配，構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac HTA-VP73。以引物對(duì)primerF和primerR對(duì)pFastBac HTA-VP73進(jìn)行PCR鑒定。另根據(jù)酶切圖譜分析結(jié)果，對(duì)pFastBac HTA-VP73分別進(jìn)行EcoRⅠ和PstⅠ雙酶切、SpeⅠ單酶切和HindⅢ單酶切鑒定。上述處理后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，所得片段大小均與預(yù)期一致（圖2），表明重組轉(zhuǎn)座載體pFast-Bac HTA-VP73結(jié)構(gòu)組成正確。

圖1 重組質(zhì)粒pMD18T-VP73ZH的酶切鑒定結(jié)果Fig.1 Enzyme digestion identification of recombinant plasmid pMD18T-VP73ZH

2.3 重組表達(dá)載體Bacmid-VP73的鑒定

分別用引物組primerF、primerR和pUC／M13 Forward、pUC／M13Reverse對(duì)Bacmid-VP73、Bacmid-CAT和Bacmid-HTA進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)。前者PCR中，只在Bacmid-VP73為模板的PCR反應(yīng)中出現(xiàn)了VP73基因1200bp的片段，而未插入VP73基因的Bacmid-CAT和Bacmid-HTA均沒有，與預(yù)期一致（圖3 A）。后者 PCR 中，Bacmid-VP73、Bacmid-CAT 為模板的PCR反應(yīng)中分別出現(xiàn)了大約3 600bp和3 000bp的片段，與預(yù)期一致（圖3B）。

圖2 pFastBac HTA-VP73的PCR和酶切鑒定結(jié)果Fig.2 PCR and enzyme digestion identification of pFastBac HTA-VP73

圖3 Bacmid-VP73的PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR identification of Bacmid-VP73

2.4 重組桿狀病毒Bacmid-VP73轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9的病變情況

將重組桿狀病毒Bacmid-VP73轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，同時(shí)設(shè)立Bacmid-pFastBac HT-CAT作陽性對(duì)照、Bacmid-pFastBac HTA作陰性對(duì)照，以及細(xì)胞空白對(duì)照，72h后觀察細(xì)胞病變情況。與空白對(duì)照細(xì)胞組比較，發(fā)生病變的細(xì)胞組細(xì)胞數(shù)量明顯較少，生長緩慢甚至停滯，細(xì)胞個(gè)體膨脹，體積變大，胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒物，部分細(xì)胞發(fā)生破裂、溶解。

2.5 SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)結(jié)果

分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白主要存在于細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)上清中可檢測(cè)到少量重組蛋白。SDS-PAGE電泳后，蛋白膠先使用InVisionTM His-tag In-gel Stain蛋白膠染色試劑盒（按試劑盒操作說明書）對(duì)蛋白膠進(jìn)行染色。該試劑盒的染液中含有六組氨酸抗體，可以與帶有六組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白結(jié)合，并在紫外光照射下發(fā)出亮光，該試劑盒的檢測(cè)靈敏度與使用六組氨酸抗體進(jìn)行的Western blot轉(zhuǎn)膜雜交相當(dāng)，由于操作簡便和穩(wěn)定性好，該檢測(cè)方法目前已被廣泛采用。在紫外光照射下，可見65ku和26ku 2個(gè)明顯亮帶（圖4B），大小分別與VP73重組蛋白和陽性對(duì)照CAT蛋白的預(yù)期大小相符。

再以考馬斯亮藍(lán)對(duì)蛋白膠進(jìn)行染色，有同樣大小的2條表達(dá)條帶（圖4A）。

結(jié)果表明VP73重組蛋白和CAT陽性對(duì)照蛋白均在昆蟲細(xì)胞Sf9中成功表達(dá)，且均帶有6組氨酸標(biāo)簽。

采用非洲豬瘟標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)重組VP73蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，只在65ku處出現(xiàn)特異性印跡條帶（表達(dá)產(chǎn)物有部分降解，因此印跡條帶有拖尾現(xiàn)象），CAT陽性對(duì)照蛋白處沒有印跡條帶（圖5）。表明昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)的VP73蛋白能被相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)血清所識(shí)別，具有良好的反應(yīng)原性。

2.6 非洲豬瘟間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）的初步建立

按方法1.2.5制備了蛋白濃度分別為64、32、16、8、4μg／mL的抗原包被液，完成ELISA板的包被。對(duì)各種稀釋度的ASFV陽性標(biāo)準(zhǔn)血清和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清，以及豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒（2型）病和豬細(xì)小病毒病等豬陽性血清進(jìn)行ASFV血清抗體的iELISA檢測(cè)，讀取OD450nm值。

圖4 Sf9細(xì)胞中VP73重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE of recombinant protein VP73 expressed in Sf9cells

圖5 Sf9細(xì)胞中VP73重組蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Western blot results of recombinant protein VP73 expressed in Sf9cells

以P／N≥2.1，且OD450nm≥0.4時(shí)的最大稀釋度為最佳抗原包被液濃度和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清最佳稀釋度。經(jīng)檢測(cè)，確定最佳抗原包被液濃度為32μg／mL，ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清最佳稀釋度為1∶200。陰性結(jié)果的平均OD450nm值為0.421，ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清結(jié)果的平均OD450nm值為1.742，相差1.32以上。在對(duì)豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒（2型）病和豬細(xì)小病毒病等豬陽性血清的檢測(cè)中未發(fā)現(xiàn)有交叉反應(yīng)，初步建立了基于ASFV真核表達(dá)重組蛋白VP73的iELISA檢測(cè)方法。

3 討論

ASFV含有約150種蛋白，目前國內(nèi)外研究較多的 ASFV 蛋白主要有 VP73、VP72、P54、I14L、j5R等［1，7］。VP73蛋白是 ASFV 的主要抗原性結(jié)構(gòu)蛋白，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在感染初期就能檢測(cè)到，且產(chǎn)量和抗原性都極為穩(wěn)定，可作為ASFV血清學(xué)診斷的主要材料［1］。國外多個(gè)檢測(cè)ASFV的ELISA商業(yè)試劑盒均基于VP73蛋白研制，表明VP73蛋白具備良好的特異性、抗原性和穩(wěn)定性，這也是本研究選定非洲豬瘟VP73蛋白作為研究對(duì)象并研制基于VP73蛋白的iELISA試劑盒的主要原因。

當(dāng)前，我國對(duì)于ASFV VP73蛋白的重組表達(dá)多見于原核表達(dá)［8-9］，而進(jìn)行真核表達(dá)的鮮有報(bào)道，可能是因?yàn)檎婧吮磉_(dá)比原核表達(dá)獲得的重組蛋白的表達(dá)量一般較低的緣故，對(duì)下游蛋白利用可能帶來一些影響［10］。本研究利用pFastBac HTA昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞Sf9中成功表達(dá)了非洲豬瘟VP73蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)和軟件分析統(tǒng)計(jì)，VP73重組蛋白主要以可溶形式（超過80%）存在于細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞裂解離心沉淀的細(xì)胞碎片中也能檢測(cè)到少量的VP73重組蛋白（少于15%）。VP73重組蛋白可溶部分約占Sf9昆蟲細(xì)胞蛋白總量的35%～40%，實(shí)現(xiàn)了較高量的重組蛋白表達(dá)，有利于蛋白的純化（另文發(fā)表）。

本研究選擇對(duì)ASFV的VP73蛋白進(jìn)行真核表達(dá)，還基于真核表達(dá)系統(tǒng)在蛋白翻譯后修飾方面較原核表達(dá)系統(tǒng)存在的優(yōu)勢(shì)，即具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工，如二硫鍵的形成、糖基化、磷酸化和正確折疊等［10］，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白，生物活性高，使用時(shí)對(duì)脊椎動(dòng)物安全，適用于蛋白下游工程的推廣應(yīng)用。經(jīng)InVisionTM His-tag In-gel Stain蛋白膠染色和Western blot檢測(cè)，顯示表達(dá)的VP73重組蛋白與六組氨酸抗體、ASFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清均能特異性結(jié)合，表明獲得的重組蛋白VP73帶有六組氨酸標(biāo)簽，也具備了良好的特異性和反應(yīng)原性。以重組蛋白VP73為包被抗原建立的基于VP73重組蛋白的ASFV血清抗體iELISA方法，特異性和穩(wěn)定性良好。下一步計(jì)劃利用VP73真核表達(dá)重組蛋白制備特異性多抗或單抗，研制檢測(cè)ASFV的競(jìng)爭ELISA檢測(cè)方法和試劑，有望打破我國長期以來依賴進(jìn)口ASFV商業(yè)ELISA檢測(cè)試劑盒的局面，開發(fā)具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的ASFV檢測(cè)技術(shù)和試劑，進(jìn)一步做好我國防控ASFV傳入的技術(shù)儲(chǔ)備。

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