活豬攜帶豬瘟病毒檢測方法比較

胡 杰，梁 媛，莫勝蘭，張步嫻，施開創(chuàng)，屈素潔，粟艷瓊，陸文俊，蘇 凱，李 軍

（廣西動物疫病預防控制中心，廣西南寧530001）

豬瘟（Classical swine fever，CSF ）是由黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）的豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，可感染各年齡的豬，一年四季都可流行，發(fā)病率和病死率均很高，由于其發(fā)生頻繁，危害大，流傳分布廣泛，至今仍是世界防控的主要動物疫病之一。CSFV的檢測方法包括常規(guī)病毒分離鑒定、兔體交互免疫試驗、ELISA、熒光抗體染色法和RT-PCR等，特別是隨著分子生物學技術的發(fā)展，對CSFV的檢測方法發(fā)展很快，出現(xiàn)了套式PCR、一步法RT-PCR、多重RT-PCR、實時熒光定量PCR等方法［1-8］，但這些方法在基層很難大面積推廣應用，尤其是養(yǎng)殖企業(yè)在人員、設備、技術等方面存在著較大差異，還是傾向于使用熒光抗體法、ELISA等快速、簡單易操作的檢測技術。這些方法在豬瘟的診斷上各有優(yōu)缺點，但各方法間的具體差異沒有詳細資料，CSFV檢測方法進行比較的資料有桂祎等［9］用RT-PCR與ELISA試驗比較，張朝紅等［10］用病毒分離鑒定、熒光抗體法、RT-PCR和夾心ELISA 4種方法檢測23份病料的比較；王向鵬等［11］用病毒分離、膠體金免疫層析試紙條、抗原捕捉ELISA、RT-PCR、TaqMan熒光定量 RT-PCR（RT-qPCR）和反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導等溫擴增（RTLAMP）等6種方法，分別對50份疑似豬瘟病料中的CSFV進行檢測；袁雪梅等建立了SYBR Green和TaqMan探針的兩種熒光定量PCR檢測方法，并進行比較［12］。上述資料多數(shù)是對病死豬進行檢測，還未見有資料對活豬的不同樣品間的差異進行比較。本試驗對豬的全血、血清、扁桃體和精液4種不同樣品用CSFV糖蛋白ErnsELISA、RT-PCR、CSFV抗原ELISA、熒光抗體染色法4種方法進行檢測比較，觀察不同樣品的檢測差異及不種方法之間的復合性、重復性等特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 分別采集廣西貴港和橫縣2個豬場的母豬全血、血清和扁桃體樣品各20份和40份，要求所有樣品一一對應，并于1個月后再次采集上述樣品；同時采集2個場的種公豬精液各15份，并于1個月后再次采集1次，兩次采集的樣品進行相同方法檢測。

1.1.2 試劑 CSFV糖蛋白ErnsELISA試劑盒、CSFV抗原ELISA試劑盒購自北京愛德士世紀元亨有限公司，批號分別為172-480，433902-3320；蛋白酶K為Merxk公司的產(chǎn)品；MiniBEST viral RNA／DNA Extraction Kit Ver.3.0購自寶生物工程（大連）有限公司；凝膠電泳試劑，6×Loading buffer，昆明云科生物技術有限公司產(chǎn)品；dNTPs、M-MLV RTase、Taq 酶，Promega 公 司 產(chǎn) 品；DL Marker 2 000，上海生工生物工程技術服務有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物合成 參照文獻［13］設計，其根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫經(jīng)典毒株NS3基因序列設計，引物序列為上游引物P1：5′-GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG-3′，下游引物P2：5′-TGATGCTGTCACACAGGTGAA-3′，對豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株、豬瘟病毒石門系強毒株均能擴增出508bp目的片段，而對牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）則不能擴增出片段，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.1.4 對照毒株來源 豬瘟病毒兔化弱毒株由廣西生物制品廠提供，豬瘟病毒石門強毒株種毒由廣西獸醫(yī)研究所惠贈；BVDV Oregon C24V株，購自中國獸藥監(jiān)察所。陽性樣品對照包括豬瘟病毒陽性扁桃體、陽性全血樣品、公豬精液均為本實驗室從豬瘟發(fā)病豬場分離、保存；豬瘟陽性血清購中國農(nóng)業(yè)科學院自蘭州獸醫(yī)研究所，批號為20110312。

1.2 方法

血清樣品進行CSFV糖蛋白ErnsELISA檢測，扁桃體樣品進行熒光抗體、CSFV抗原ELISA和RT-PCR檢測，全血樣品和公豬精液進行CSFV抗原ELISA和RT-PCR檢測。

1.2.1 CSFV糖蛋白 Erns（gp44／48）ELISA檢測方法 按試劑盒說明書進行。

1.2.2 熒光抗體染色法 由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所完成。

1.2.3 CSFV抗原ELISA方法 按試劑盒說明進行測定。

1.2.4 RT-PCR方法

1.2.4.1 樣品RNA抽提 按TaKaRa RNA／DNA抽提試劑盒說明進行抽樣。

1.2.4.2 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）過程取16μLRNA與1μL的下游引物（25pmol／μL）混勻，于PCR儀中70℃5min、90℃5min后，立即放入冰浴中5min；再在上液中加入如下試劑：5×buffer 5μL，dNTP（2.5mmol／L）4μL，Rnasin 0.5μL，M-MULV Reverse Transcriptase 0.5μL，置PCR儀中42℃反轉(zhuǎn)錄1h后于-20℃保存?zhèn)溆?；再進行PCR擴增，體系為50μL，其中滅菌去離子水34μL，10×buffer 5μL，dNTP（2.5mmol／L）4μL，cDNA4 μL，P1（25pmol／μL）1 μL ，P2（25pmol／μL）1 μL， Taq DNA polymerase（5μ／μL）1μL，按如下程序擴增 ：94 ℃ 預變性10min；94℃1min，53℃1min，72℃1min 30s，35個循環(huán)；72℃ 延伸10min。PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳并拍照。

2 結果

2.1 2個場母豬3種樣品（扁桃體、全血、血清）檢測結果

從檢測方法差異上看，第1次檢測時，熒光抗體染色法、CSFV糖蛋白ErnsELISA、CSFV ELISA、RTPCR 4種檢測方法在貴港和橫縣2個場3種樣品的檢測結果完全吻合的數(shù)量分別為15份和2份，吻合率分別為37.50%（15／40）、10.00%（2／20）；第2次檢測時，2個場3種樣品結果完全吻合的數(shù)量分別為21份和7份，吻合率分別為52.50%（21／40）和35.00%（7／20）。若不考慮熒光抗體染色法，2個場3種樣品第1次檢測時在CSFV糖蛋白ErnsELISA、CSFV ELISA、RT-PCR 3種方法結果完全吻合的數(shù)量分別為19份和12分，吻合率分別為47.33%（19／40）和60.00%（12／20），說明熒光抗體染色法與CSF糖蛋白ErnsELISA、CSFV ELISA、RT-PCR存在較大差異，后3種方法有比較高的吻合率（表1和表2）。

從樣品類別來看，扁桃體的檢出率最高，其次是全血樣品，最低是血清；但從RT-PCR、CSFV抗原ELISA方法和CSFV糖蛋白 Erns（gp44／48）ELISA 3種方法看，全血樣品的檢出率高于扁桃體（表1和表3）。

表1 貴港豬場母豬檢測結果Table 1 The detection result of sow in Guigang pig farm

表2 橫縣豬場母豬檢測結果Table 2 The detection result of sow in Hengxian pig farm

表3 2次檢測結果匯總Table 3 Summary of detection results in two tests

從檢出陽性率看，4種檢測中熒光抗體染色法中扁桃體檢出率最高為75%；其次是用RT-PCR方法，全血樣品平均檢出率為38.75%，扁桃體為35%；CS-FV抗原ELISA方法檢出率第3，全血樣品平均檢出率為23.13%，扁桃體平均為22.50%；CSFV糖蛋白Erns（gp44／48）ELISA檢出率最低，血清平均檢出率為19.38%（表3）。

從檢測的重復性看，CSFV抗原ELISA的檢測方法重復性最高，扁桃體和全血平均吻合率分別為87.50%和96.25%%；RT-PCR方法第2，扁桃體和全血平均吻合率分別為75.13%和77.50%；CSFV糖蛋白ErnsELISA方法最低，平均吻合率為71.25%；CSFV抗原ELISA和RT-PCR方法中均是全血樣品重復性高于扁桃體 （表4）。

表4 不同方法2次檢測吻合率匯總Table 4 Summary of detection result using different ways in two tests

2.2 2個豬場公豬精液的檢測結果

用CSFV抗原ELISA和RT-PCR方法2次檢測2個場的種公豬精液均是RT-PCR方法檢出率高于CSFV抗原ELISA方法，其中貴港場檢出率分別是40.00%和33.33%，橫縣場檢出率分別是33.33%和26.67%（表5）。

表5 2個場種公豬精液檢測結果Table 5 The detection result of swine semen in two farms

2.3 RT-PCR的檢測結果

從圖1和圖2可以看出，標準石門強毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株均能擴增出約508bp目的片段，而BVDV、生理鹽水未擴增出相應片段，為陰性，檢測樣品中2、3、4、10也均能擴增出與標準石門強毒株、豬瘟兔化弱毒疫苗株相同的目的片段，為陽性；檢測樣品5、6未能擴增出任何片段，為陰性。

圖1 豬瘟病毒RT-PCR檢測結果Fig.1 CSFV RT-PCR detection results

圖2 豬瘟病毒RT-PCR檢測結果Fig.2 CSFV RT-PCR detection results

3 討論

本試驗中扁桃體的檢出率最高，其次是全血樣品，血清樣品最低。4種方法中熒光抗體敏感性最高，RT-PCR方法的敏感性次之，CSF抗原ELISA方法敏感性第3，重復性最好，CSFV糖蛋白ErnsELISA敏感性最低。這幾種方法各有優(yōu)缺點。熒光抗體法對實驗人員和儀器有一定要求，過去臨床診斷中多推薦采用CSFV熒光抗體檢測法，該方法需活體取扁桃體，操作復雜，易出現(xiàn)非特異性熒光，對結果判定人員的素質(zhì)要求相對較高。扁桃體是豬的免疫器官，采集后豬不愿吃食，出現(xiàn)掉膘，所以不建議采用熒光抗體法；RT-PCR方法不能區(qū)分是疫苗株和野毒感染，對操作人員要求較高，還要專門的儀器，同時易出現(xiàn)假陽性，但對全血樣品和扁桃體檢測均能特異性的檢測，可作為初步篩選；CSFV抗原ELISA方法相對來說準確性高、重復性好，可首選，雖然CSFV糖蛋白ErnsELISA的敏感性最低，但可檢測出豬群是否感染豬瘟病毒野毒，可作為控制與凈化CSF時的備選方法。

CSFV糖蛋白ErnsELISA與CSFV抗原ELISA方兩種方法的符合率較高，達75%。血清樣品與全血樣品存在差異。原因是糖蛋白ErnsELISA主要針對糖蛋白Erns，而CSFV抗原ELISA方法主要針對E2蛋白，E2蛋白是CSFV主要的保護性抗原，是產(chǎn)生中和抗體的主要成分，兩者側重點不同，敏感性存在差異屬正常情況。另外，全血樣本的敏感性高于扁桃體樣本，這可能與病毒發(fā)展的時期不同，第2次檢測時病毒已發(fā)展到病毒血癥，所以血液的檢出率高于扁桃體樣品。

本試驗在對2個場的公豬精液進行檢測時，發(fā)現(xiàn)公豬精液均有CSFV，貴港場平均陽性率在33.33%以上，橫縣場在26.67%以上，但2個場公豬卻不表現(xiàn)臨床癥狀。眾所周知，帶毒公豬可通過精液將病毒傳染給母豬。帶毒母豬妊娠后病毒通過胎盤屏障感染胎兒造成垂直傳播，產(chǎn)下帶毒的仔豬或僵豬不斷產(chǎn)毒、排毒，污染環(huán)境，感染其他健康豬，形成惡性循環(huán)。種公豬在該病的傳播中也起著重要作用，病毒可通過帶毒公豬精液垂直傳播。因此，加強公豬，特別是種公豬的CSFV檢測，從種源控制與凈化豬瘟至關重要。

如果規(guī)?；B(yǎng)豬企業(yè)要自行進行大規(guī)模CSFV控制與凈化工作，建議采用多種方法聯(lián)合應用。即不同類別的動物采用不同的方法進行CSFV病原檢測。主要分為幾下幾種情況：①種公豬：可采集精液，先用RT-PCR初步篩選，再用CSFV抗原ELISA，兩種方法聯(lián)合應用，均出現(xiàn)陽性者淘汰；②種母豬：采集全血和血清樣品，先用RT-PCR初步篩選，再CSFV抗原ELISA復查，兩種方法聯(lián)合進行對應檢測，均出現(xiàn)陽性者淘汰；③后備豬和小豬：RT-PCR初篩或CSFV抗原ELISA篩選。

［1］ 魯建民，熊忙利.豬瘟病毒套式PCR檢測方法的建立［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)：科技版，2010（10）：129-30.

［2］ 魏淑英，張啟迪，劉煥奇，等.巢式PCR技術在CSF病毒檢測中的應用［J］.畜禽業(yè)，2008（5）：6-8.

［3］ 任夫渡，張 志，張麗麗，等.豬瘟病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立［J］.動物醫(yī)學進展，2011，32（5）：82-85

［4］ 殷進方，吳志鵬，江燦芬，等.豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（10）：142-144.

［5］ 田莉莉，李 林.熒光定量PCR技術在豬病毒病診斷上的應用［J］.中國農(nóng)學通報，2011，27（26）：47-51.

［6］ Pérez L J，Díaz de Arce H，Tarradas J，et，al.Development and validation of a novel SYBR Green real-time RT-PCR assay for the detection of classical swine fever virus evaluated on different realtime PCR platforms［J］.J Virol Meth，2011，174（1-2）：53-59.

［7］ Huang Y L，Pang V F，Pan C H，et al.Development of a reverse transcription multiplex real-time PCR for the detection and genotyping of classical swine fever virus［J］.J Virol Meth，2009，160（1-2）：111-118.

［8］ Leifer I，Blome S，Beer M，et al.Development of a highly sensitive real-time RT-PCR protocol for the detection of classical swine fever virus independent of the 5＇untranslated region［J］.J Virol Meth，2011，171（1）：314-317.

［9］ 桂 祎，李 瓊，李彥兵，等.豬瘟病毒RT-PCR核酸檢測與EL ISA抗原檢測應用研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（7）：184-186.

［10］ 張朝紅，張彥明，張永國，等.豬瘟病毒4種檢測方法的比較［J］.西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2007，35（5）：24-28.

［11］ 王向鵬，張興娟，孫 元，等.六種檢測豬瘟病毒方法的比較.微生物學報，2010，50（8）：1087-1093.

［12］ 袁雪梅，陳 寧，陳 宇，等..兩種熒光定量PCR方法檢測豬瘟病毒的比較及應用，中國動物傳染病學報2010，18（3）：66-72.

［13］ 羅廷榮，莫 揚，吳文德，等.RT-PCR技術檢測豬瘟病毒的應用研究［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2004，26（4）：307-309，312.