副豬嗜血桿菌主要外膜蛋白基因研究進展

張 斌，湯 承，岳 華

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis）是豬上呼吸道的一種共棲菌，可在特定條件下侵入機體引起嚴重的全身性疾病，以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征。副豬嗜血桿菌病在世界上許多養(yǎng)豬國家廣泛存在，已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要細菌性疾?。?］。

外膜是革蘭陰性菌細胞壁中的特有結(jié)構(gòu)，它位于細菌胞漿膜和肽聚糖層的外側(cè)，包圍整個細菌，具有典型的非對稱性的磷脂雙層結(jié)構(gòu)。位于外膜上的蛋白總稱為外膜蛋白（outer membrane proteins，OMP）［2］。在革蘭陰性菌中，OMP在細菌致病和免疫具有一定的聯(lián)系。在H.parasuis中，OMP是潛在的毒力因子也具有良好的免疫源性。Ruiz A等［3］比較了從發(fā)病豬的實質(zhì)器官和健康動物的上呼吸道分離的不同H.parasuis的OMP型，發(fā)現(xiàn)SDS-PAGE電泳圖譜上有6個～7個分子質(zhì)量不同外膜蛋白。發(fā)現(xiàn)36.3ku～38.5ku OMP只在發(fā)病豬中分離菌株存在，而在健康動物的上呼吸道分離株中是缺失的，因此推測該分子量范圍的OMP可能與毒力相關(guān)。在免疫方面，Miniats O P等［4］證明免疫豬的血清中只有針對OMP的抗體而不存在針對脂多糖和莢膜多聚糖的抗體，這證明了OMP具有較強的免疫原性。Fuente A J等［5］用H.parasuis的OMP作為疫苗免疫豬，能對同型菌株的攻擊產(chǎn)生部分保護作用，證明OMP中存在保護性抗原。但具體是外膜蛋白的哪一組分尚不清楚。Zhou M等［6］利用蛋白組學(xué)方法在H.parasuis SH0165菌株的OMP中尋找能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫保護的蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OmpP2、D15、PalA 和 HPS-06257能產(chǎn)生相對高的保護力，這就暗示這4個蛋白能作為潛在的疫苗抗原。

H.parasuis參考菌株29755和分離株SH0165的基因組已經(jīng)公布，但絕大多數(shù)基因的功能還不清楚。從2個基因組中都發(fā)現(xiàn)了6個編碼主要外膜蛋白的基因，這些基因在細菌的感染與免疫中發(fā)揮的具體作用還不清楚。本文對H.parasuis 6個主要的OMP基因特點和潛在功能進行綜述。

1 外膜蛋白P1基因與編碼的蛋白

外膜蛋白 P1（outer membrane protein P1，OmpP1）屬于轉(zhuǎn)運蛋白。分離株SH0165的OmpP1基因長1 290bp，編碼429個氨基酸，預(yù)測的分子質(zhì)量46.02ku。H.parasuis與其他巴斯德菌科細菌相比，如肺炎胸膜放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）、杜克雷嗜血桿菌（Haemophilus ducreyi）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）和睡眠嗜血桿菌（Haemophilus somnus）等基因同源性為47.2%～53.3%。系統(tǒng)進化分析表明H.parasuis的OmpP1基因單獨聚為一支，并與肺炎胸膜放線桿菌、杜克雷嗜血桿菌的親緣關(guān)系較近（圖1）。

在流感嗜血桿菌，OmpP1約占外膜蛋白的10%，是一個保護性抗原。OmpP1抗體在小鼠動物模型中有良好的保護力［7-8］。在流感嗜血桿菌中，OmpP1二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)8個潛在的表面暴露環(huán)，其中4個表面暴露的環(huán)已證實具有免疫功能［9］。比對流感嗜血桿菌OmpP1蛋白的研究，我們預(yù)測H.parasuisOmpP1也可能是一個疫苗候選抗原。

圖1.H.parasuis與其他巴斯德菌科細菌的OmpP1基因的系統(tǒng)進化樹分析Fig.1 The phylogenetic tree analysis of OmpP1gene from H.parasuis with its homologous genes from Pasteurellaceae family

2 外膜蛋白P2基因與編碼的蛋白

外膜蛋白P2（outer membrane protein P2，OmpP2）屬微孔蛋白，在15個血清型參考菌株中OmpP2基因長度為1 077bp～1 203bp，編碼358個～400個氨基酸，編碼蛋白大小為38.49ku～43.35ku，不同血清型之間氨基酸同源性為83.9%～99.4%，與其他巴斯德菌科細菌相比氨基酸之間的同源性為28.7%～42.1%。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)H.parasuisOmpP2基因單獨聚為一支，并與肺炎胸膜放線桿菌、小放線桿菌的親緣關(guān)系較近（圖2）。

圖2 H.parasuis與其他巴斯德菌科細菌的OmpP2基因的系統(tǒng)進化樹分析Fig.2 The phylogenetic tree analysis of OmpP2gene from H.parasuis with its homologous genes from Pasteurellaceae family

微孔蛋白常以非共價鍵與肽聚糖、脂多糖緊密結(jié)合，可形成相對非特異性的通道或透道，具有通透性［10］。在革蘭陰性細菌中，微孔蛋白不但具有維持細胞膜的通透性和穩(wěn)定性等功能，還參與細菌的致病過程，如黏附、入侵、抵抗補體殺菌和促進炎癥反應(yīng)等。研究發(fā)現(xiàn)OmpP2在H.parasuisOMP中的含量最為豐富［6］，也是受關(guān)注度最高的外膜蛋白。Zhou M等［6］用重組的OmpP2蛋白免疫注射小鼠后，用5LD50的SH0165菌株攻毒可產(chǎn)生80%保護率。Mullins M A 等［11］發(fā) 現(xiàn)H.parasuisOmpP2蛋白的序列具有豐富的遺傳多樣性，這種序列異質(zhì)性可能與宿主的免疫壓力相關(guān)，也可能與菌株的毒力有一定的聯(lián)系。趙倩等［12］發(fā)現(xiàn)H.parasuisOmpP2基因存在兩種結(jié)構(gòu)類型，即參考菌株血清型為2、4、5、10、12、13、14和15的菌株中 OmpP2基因存在兩處連續(xù)堿基缺失，而參考菌株血清型為1、3、6、7、8、9和11的菌株中OmpP2基因沒有出現(xiàn)缺失，暗示這種缺失現(xiàn)象主要出現(xiàn)在強毒力血清型的菌株中，OmpP2基因有可能是區(qū)分H.parasuis強、弱毒力菌株的分子靶標。Zhang B等［13］構(gòu)建了血清4型分離株的OmpP2基因缺失株，研究發(fā)現(xiàn)缺失株生長緩慢和對補體介導(dǎo)的血清殺菌作用敏感性增加。另外，發(fā)現(xiàn)具堿基缺失型OmpP2蛋白的H.parasuis更能抵抗補體殺菌的作用。OmpP2基因的缺失還表現(xiàn)出對豬肺泡巨噬細胞黏附能力和細胞外的生存能力下降。同時，從SC096菌株提取純化的OmpP2蛋白也能介導(dǎo)對肺泡巨噬細胞的黏附作用［14］。以上結(jié)果表明H.parasuisOmpP2是一個免疫保護性蛋白，在維持細菌生長、抵抗血清中補體殺菌作用和對宿主細胞的黏附作用中發(fā)揮著重要的作用。

3 表面抗原D15基因與編碼的蛋白

H.parasuis表面抗原D15（surface antigen D15）屬于微量外膜蛋白。SH0165的D15基因長1734bp，編碼577個氨基酸，預(yù)測分子質(zhì)量為66.23ku，與其他巴斯德菌科細菌的表面抗原D15的同源性為47.3%～57.1%。系統(tǒng)進化分析表明，H.parasuisD15基因單獨聚為一支，與肺炎胸膜放線桿菌、杜克雷嗜血桿菌的親緣關(guān)系較近（圖3）。

圖3 H.parasuis與其他巴斯德菌科細菌的D15基因的系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 The phylogenetic tree analysis of D15gene from H.parasuis with its homologous genes from Pasteurellaceae family

在革蘭陰性菌中，微量外膜蛋白雖含量低，但發(fā)揮著重要的作用。在H.parasuis中，D15蛋白被認為是候選疫苗抗原。用重組的D15蛋白免疫小鼠，攻毒后能產(chǎn)生60%的保護率［6］。在流感嗜血桿菌中，D15蛋白也是一個保護性抗原［15］。研究發(fā)現(xiàn)b型流感嗜血桿菌D15重組蛋白不僅與不同血清型的菌株，也可以與副流感嗜血桿菌發(fā)生交叉反應(yīng)，純化的重組D15蛋白抗體對小鼠的菌血癥具有保護作用。

4 外膜蛋白26基因與編碼的蛋白

H.parasuis外膜蛋白26（outer membrane protein 26，OmpP26）屬于外膜蛋白H家族（outer membrane protein H，OmpH）。SH0165 的OmpP26基因長804bp，編碼267個氨基酸，預(yù)測分子質(zhì)量為29.76ku。OmpP26與同源的Skp轉(zhuǎn)運蛋白、OmpH蛋白高度保守［16-17］。多殺性巴氏桿菌、流感嗜血桿菌、杜克雷嗜血桿菌等均具有OmpH家族的外膜蛋白，且在氨基酸同源性為37.6%～54.5%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明H.parasuis的OmpP26基因單獨聚為一支，并與肺炎胸膜放線桿菌、杜克雷嗜血桿菌的親緣關(guān)系較近（圖4）。

圖4 H.parasuis與其他巴斯德菌科細菌的OmpP26基因的系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 The phylogenetic tree analysis of OmpP26gene from H.parasuis with its homologous genes from Pasteurellaceae family

在流感嗜血桿菌中，OmpP26位于遺傳結(jié)構(gòu)的一個高度保守區(qū)域，并且在革蘭陰性細菌中的同源序列也是高度保守的，表明該蛋白具有重要的功能。通過氣管免疫小鼠模型研究表明，OmpP26能夠顯著增強肺對不定型的流感嗜血桿菌的清除率［17］。OmpP26經(jīng)黏膜途徑免疫小鼠后，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。同型或異型的菌株攻擊免疫了動物時，顯著增強了攻毒4h后的肺臟內(nèi)細菌清除率。缺少信號肽序列的OmpP26重組蛋白能引起支氣管肺泡灌洗液和免疫血清中IgG和IgA抗體滴度顯著增加；而具有信號肽序列的OmpP26重組蛋白在增強肺清除率上更有效，能夠介導(dǎo)較強的細胞免疫反應(yīng)［18］。此外，OmpP26重組蛋白介導(dǎo)較高的全身性和黏膜抗體的總體水平，與提取的天然蛋白介導(dǎo)的抗體水平相當(dāng)［16］。

5 鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白基因與編碼的蛋白

H.parasuis鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白（iron-regulated outer membrane protein，Iron-regulated OMP）也屬于OmpH。Iron-regulated OMP基因長2 394 bp，編碼797個氨基酸，預(yù)測分子質(zhì)量為90.68ku。與其他巴斯德菌科細菌的鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白基因同源性為38%～56.3%。系統(tǒng)進化分析表明，H.para-suis的鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白基因單獨聚為一支，并與肺炎胸膜放線桿菌和溶血性曼氏桿菌的親緣關(guān)系較近（圖5）。

圖5 H.parasuis與其他巴斯德菌科細菌的鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白基因的系統(tǒng)進化樹分析Fig.5 The phylogenetic tree analysis of Iron-regulated OMP gene from H.parasuis with its homologous genes from Pasteurellaceae family

鐵離子是細菌生長繁殖必需的營養(yǎng)因子之一。Keumhwa C K等［19］研究發(fā)現(xiàn)一些病原菌之所以能在宿主體內(nèi)增殖，是因為限鐵條件迫使細菌產(chǎn)生高親和性的攝鐵系統(tǒng)，主要有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、乳鐵蛋白受體及鐵載體等［20］，其與宿主競爭攝取鐵離子復(fù)合物，從而獲取鐵以滿足自身代謝需要。這些蛋白僅在限鐵條件下表達，故被稱為鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白。研究表明溶血性曼氏桿菌，牛、禽及豬多殺性巴氏桿菌、流感嗜血桿菌及腦膜炎奈瑟氏菌等在限鐵條件下均能表達這些蛋白。禽多殺性巴氏桿菌和豬多殺性巴氏桿菌在體內(nèi)增殖時表達的鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白具有交叉免疫保護作用［21］。兔多殺性巴氏桿菌在限鐵條件下表達的鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白也具有交叉免疫原性［22］。在小鼠模型上，比較了兔多殺性巴氏桿菌鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白的免疫原性及交叉免疫保護效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白組的抗體滴度＞外膜蛋白組的抗體滴度＞全菌組的抗體滴度。小鼠在被動免疫后攻毒，鐵調(diào)節(jié)外膜蛋白組具有很好的保護力，同時也具有一定的交叉保護力［23］。

6 外膜蛋白P5基因與編碼的蛋白

外膜蛋白 P5（outer membrane protein P5，OmpP5）屬于外膜蛋白A家族。參考菌株27955全基因組中的OmpP5基因長1 104bp，編碼367個氨基酸，預(yù)測分子質(zhì)量為39.5ku。OmpP5蛋白的前21個氨基酸殘基組成信號肽，成熟的OmpP5由346個的氨基酸組成，預(yù)測蛋白的分子質(zhì)量為37.48ku。而SH0165的OmpP5基因長1 119bp，編碼372個氨基酸，說明了相同的血清型存在不同基因長度和結(jié)構(gòu)特點。H.parasuis血清4、5型的參考菌株與其他巴斯德菌科菌株相比，如海藻巴斯德菌、葡萄糖曼海姆菌、豬放線桿菌、溶血曼海姆菌、溶血性巴氏桿菌、杜克雷嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌，OmpP5氨基酸同源性為54.2%～74.8%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，H.parasuis血清4、5型的OmpP5基因單獨聚為一支，并與海藻巴斯德菌的親緣關(guān)系最近（圖6）。

圖6 H.parasuis與其他巴斯德菌科細菌的OmpP5基因系統(tǒng)進化樹分析Fig.6 The phylogenetic tree analysis of OmpP5gene from H.parasuis with its homologous genes from Pasteurellaceae family

外膜蛋白A家族又稱熱修飾蛋白（heat-modifiable protein），在革蘭陰性菌的分子質(zhì)量大約34ku～36ku。OmpA是革蘭陰性菌外膜中的主要成分并具有保守性，其主要作用是維持外膜的完整，缺少OmpA和胞壁脂蛋白的細菌變異株其形態(tài)為球形，細胞膜也不穩(wěn)定［24］。此外該蛋白還有黏附、入侵、參與生物被膜的形成、抵抗補體介導(dǎo)血清的殺傷和作為不同噬菌體的受體等功能。Tadjine M等［25］報道了H.parasuis的一個35ku MOMP，其N-端前12個氨基酸（-APQADSFYVGAK-）的同源性表明該蛋白可能為OmpA；而且該蛋白的單克隆抗體能與15個血清型和大量的分離株發(fā)生反應(yīng)，這個結(jié)果說明該蛋白為檢測H.parasuis的感染提供了一個良好的診斷抗原。Zhang B等［26］根據(jù)N-端前12個氨基酸序列，克隆血清4，5型的OmpP5基因并在大腸埃希菌中進行了高效表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組的OmpP5能與15個血清型的血清發(fā)生交叉反應(yīng)。也證實了OmpP5重組蛋白有潛力開發(fā)一種針對廣譜血清型的診斷工具。為了進一步研究H.parasuis其他血清型的OmpP5基因的結(jié)構(gòu)特點，Tang C等［27］克隆了H.parasuis其他13個參考菌株和20個臨床分離株的OmpP5基因。結(jié)果表明35株H.parasuis ompP5基因的完整編碼區(qū)有3個不同的長度，1 098、1 104、1 110bp，平均變異率12.6%。OmpP5二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明H.parasuis OmpP5含有4個高變區(qū)，且又位于4個推測的表面暴露的環(huán)內(nèi)。根據(jù)OmpP5基因序列的差異，將35個菌株劃分為17個序列型（STA-Q），其中STA為臨床分離株的優(yōu)勢基因型。在20個臨床分離株中，血清分型與OmpP5STs分型的結(jié)果存一定的相關(guān)性，即優(yōu)勢STA基因型菌株包括了優(yōu)勢的血清5型菌株和不能分型的菌株。與血清分型相比，OmpP5基因ST分型能對臨床分離菌株提供更詳細的菌株分類信息。在H.parasuis SC096菌株中，當(dāng)缺失了OmpP5基因，細菌的生長能力受到了明顯的影響。但野生菌株和缺失株的其他方面的表型，包括對豬和兔血清的殺菌作用、對PK-15和PUVEC的黏附入侵能力都沒有明顯的變化［28］。另外，OmpP5預(yù)測的成熟蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為36.3ku，位于與毒力相關(guān)的外膜蛋白分子質(zhì)量的范圍內(nèi)，OmpP5是否與毒力有某種聯(lián)系有待進一步研究證實。

7 問題和展望

隨著H.parasuis全基因組測序的完成，人們開始逐漸認識了不同的外膜蛋白基因特點和結(jié)構(gòu)。但是具體的功能作用和其他血清型的外膜蛋白基因和結(jié)構(gòu)特征還不是很清楚，還需進一步的研究證實。隨著新技術(shù)和新方法的不斷發(fā)展，分析鑒定H.parasuis基因功能的方法越來越多。重要的是遺傳操作自然轉(zhuǎn)化方法的建立和基因缺失株的構(gòu)建，對外膜蛋白的功能鑒定提供了技術(shù)平臺。同時，了解各種外膜蛋白的結(jié)構(gòu)特點和具體的功能，鑒定具有保護作用的外膜蛋白，為開發(fā)H.parasuis OMP亞單位疫苗提供了理論基礎(chǔ)，對H.parasuis的防治具有重要的意義。

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