赤腹松鼠腸道細(xì)菌分離鑒定及耐藥性分析

權(quán)自芳，劉 丹，楊紹林，張 蕾，顏其貴，2＊

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川雅安625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川雅安625014）

赤腹松鼠（Callosciurus erythraeus）屬于嚙齒目，松鼠科，棲息于熱帶、亞熱帶森林中，以針葉林、混交林較為常見，亦可在山崖甚至居民點(diǎn)附近活動(dòng)，以植物的嫩葉、果實(shí)、種子為主食，亦食用各種農(nóng)作物［1］。赤腹松鼠對林木危害嚴(yán)重，是四川省主要的人工林害鼠之一［2-3］。隨著森林旅游業(yè)的發(fā)展，人類和家畜與森林野生動(dòng)物接觸的機(jī)會(huì)和強(qiáng)度逐漸增大，赤腹松鼠數(shù)量巨大且分布廣泛，如果攜帶病原細(xì)菌，將會(huì)成為家養(yǎng)動(dòng)物及人類某些疾病的傳染來源。細(xì)菌耐藥已成為一個(gè)全球性問題，幾乎所有細(xì)菌都能獲得耐藥基因，幾乎每一種抗菌藥物都能被細(xì)菌中某些物質(zhì)抵抗或破壞［4］，給臨床細(xì)菌性疾病的治療帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，對人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，野生動(dòng)物源的細(xì)菌的耐藥性的研究對細(xì)菌耐藥性機(jī)理的研究具有重要的意義。

本試驗(yàn)以四川省某旅游景區(qū)的赤腹松鼠為對象，對赤腹松鼠所攜帶腸道細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，探究是否有可致人獸患病的病原細(xì)菌及其能否危害旅游資源的開發(fā)利用；在分離鑒定赤腹松鼠腸道菌群的基礎(chǔ)上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，評定在未給藥狀態(tài)下這些細(xì)菌是否對某些抗生素產(chǎn)生耐藥性，為今后研究耐藥傳遞機(jī)制提供素材。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 四川省某旅游景區(qū)健康赤腹松鼠33只。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 Tryptone（OXOID Ltd.），Yeast Extract（OXOID Ltd.）購于Sigma公司；血瓊脂、SP瓊脂、DHL瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、MH培養(yǎng)基購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司；質(zhì)粒小量抽提、凝膠回收試劑盒、Mix等購于天根生化技術(shù)有限公司；上游引物 、下游引物購于上海英俊生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料采集 采集赤腹松鼠小腸內(nèi)容物33份，具體采集、保存方法按參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行。

1.2.2 細(xì)菌分離純化 挑取小腸內(nèi)容物分別于血瓊脂、SP瓊脂、DHL瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂劃線接種，37℃培養(yǎng)48h，再根據(jù)菌落形態(tài)、大小進(jìn)行純化培養(yǎng)。根據(jù)平板上的菌落生長的形態(tài)、大小、顏色等進(jìn)行分類，對每一類典型菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，初步區(qū)分革蘭陰性和陽性菌。再根據(jù)革蘭染色特性和菌體形態(tài)，初步判定細(xì)菌類屬，進(jìn)行針對性純化培養(yǎng)。

1.2.3 16SrRNA鑒定 細(xì)菌分離純化后，抽提基因組DNA，利用16SrRNA細(xì)菌通用引物（上游引物：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′，下 游 引物：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′），進(jìn) 行16SrRNA基因片段擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：5μL10×EX Taqbuffer（Mg2＋Plus），4μL dNTP Mixture（各2.5mmol／L），1μL 下游引物（20μmol／L），1μL上游引物（20μmol／L），0.25μL TaKaRa EX Taq （5U／μL），5.0μL模板 DNA，33.75μL ddH2O。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95℃10min；95℃30s，53℃30s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7min［6］。

反應(yīng)完成后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 對鑒定的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)CLSI推薦的K-B法進(jìn)行操作。將分離鑒定的各種細(xì)菌挑取單個(gè)典型菌落接種于10mL LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h～24h，用無菌生理鹽水將旺盛生長的LB培養(yǎng)基的濁度調(diào)整到光學(xué)上相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)（1×108cfu／mL），用無菌棉拭子蘸取含菌培養(yǎng)液，均勻涂布在MH平板培養(yǎng)基上，加蓋后室溫下放置10min，用無菌眼科鑷子將藥敏紙片輕輕貼于平板上，37℃培養(yǎng)16h～18h，測量抑菌圈直徑，結(jié)果判定依據(jù)杭州微生物試劑有限公司藥敏試驗(yàn)紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。試驗(yàn)所選擇藥物包括氨芐西林、阿莫西林（復(fù)方）、鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢噻肟、阿米卡星、羅紅霉素、氟苯尼考、大觀霉素、林可霉素和泰妙菌素17種抗菌藥物。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

本試驗(yàn)從33只赤腹松鼠小腸內(nèi)容物中共分離鑒定出117株細(xì)菌，對分離菌株進(jìn)行16SrRNA基因PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察，在1 500bp處均出現(xiàn)一條明亮的目的條帶（圖1）。將PCR產(chǎn)物回收純化，送往上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果與GenBank中參考菌株16SrRNA基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析比較，根據(jù)不同屬細(xì)菌16SrRNA基因同源性為70%～90% ，而同一種內(nèi)不同株間基因同源性大于99%的判定標(biāo)準(zhǔn)，表皮葡萄球菌、金色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、熒光假單胞菌、蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌和Weihenstephanensis芽胞桿菌等分離菌株與GenBank中相關(guān)參考菌株16SrRNA基因的核苷酸序列同源性均在99%～100% 之間，從而鑒定出這些細(xì)菌的種屬。

圖1 16SrRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of 16SrRNA

赤腹松鼠腸道所攜帶的細(xì)菌主要有腸桿菌屬、葡萄球菌屬、芽胞桿菌屬、腸球菌屬、克雷伯菌屬、假單胞菌屬、明串珠菌屬，其中大腸埃希菌32株、金黃色葡萄球菌28株、松鼠葡萄球菌16株、蠟樣芽胞桿菌14株、糞腸球菌11株、表皮葡萄球菌3株、Weihenstephanensis芽胞桿菌3株、肺炎克雷伯菌2株、枯草芽胞桿菌2株、蘇云金芽胞桿菌2株、Samanii芽胞桿菌2株、熒光假單胞菌1株、腸膜樣明串珠1株（表1）。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對從赤腹松鼠腸道分離鑒定出的細(xì)菌進(jìn)行K-B法藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，這些菌株對氟苯尼考、環(huán)丙沙星等藥物敏感，而對大觀霉素、氨芐西林等藥物不敏感（表2）。

表1 赤腹松鼠腸道中細(xì)菌鑒定結(jié)果及檢出數(shù)與檢出率Table 1 Identification results，and detection number and detection rate of isolated bacterial strains of intestine of Callosciurus erythraeu%

3 討論

細(xì)菌分離鑒定出117株，13種細(xì)菌，其中一些是可導(dǎo)致人畜患病的病原菌，如肺炎克雷伯菌、Weihenstephanensis芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、Samanii芽胞桿菌對人和動(dòng)物都有一定的危害，其中蠟樣芽胞桿菌在細(xì)菌性食物中毒中比較常見，占全部食物中毒事件的4.0%，在細(xì)菌性食物中毒據(jù)第4位［7］。而肺炎克雷伯菌是人類呼吸道和腸道的常居菌，可引起下呼吸道、泌尿道、消化道、手術(shù)切口、血液、顱內(nèi)和皮膚軟組織等多個(gè)部位感染，是醫(yī)院感染和免疫缺陷者感染的重要病原菌。

表2 赤腹松鼠腸道分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug susceptibility test of the isolated bacterial strains of intestine of Callosciurus erythraeus

另一些為潛在的條件致病菌，在動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降、飼養(yǎng)環(huán)境改變或運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激反應(yīng)情況下可使動(dòng)物發(fā)病甚至死亡，如表皮葡萄球菌在通常情況下不會(huì)致病，一般只在藥物濫用者，接受免疫抑制治療的病人，艾滋病病人和早產(chǎn)兒等免疫低下的個(gè)體中引起感染，是一種機(jī)會(huì)致病菌［8］，同時(shí)它也是人體皮膚以及黏膜表面常見的寄生菌，在這些部位分離到的葡萄球菌約占65%～90%。表皮葡萄球菌是醫(yī)院感染中最常見的病原菌，也是引起醫(yī)院內(nèi)生物材料相關(guān)性感染的重要致病菌，主要在免疫力受損人群中容易引起感染，特別是在使用高分子材料留置物的病人中通過在體內(nèi)留置物這類醫(yī)學(xué)材料表面形成生物膜致病，表皮葡萄球菌致病機(jī)理與其能黏附在高分子材料表面并形成生物膜有關(guān)。大腸埃希菌通常情況下為腸道正常菌群，在飼養(yǎng)管理不良、衛(wèi)生條件差、環(huán)境溫差變化等綜合應(yīng)激因素下引起仔豬抵抗力降低，可誘發(fā)仔豬黃痢和白痢等。

其中也存在對生態(tài)有益的細(xì)菌，例如，熒光假單胞菌，它對于植物病害，特別是土傳病害如根腐病、猝倒病、枯萎病等均有很好的防治作用，是一種重要的有益微生物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有十分重要的意義；而蘇云金芽胞桿菌是目前世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的一種生防微生物，對人畜及非靶標(biāo)昆蟲無害，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值［9］。而其他大部分菌株都是動(dòng)物體內(nèi)正常的有益菌群，如枯草芽胞桿菌、糞腸球菌、腸膜樣明串珠菌等。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果中金黃色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、表皮葡萄球菌對大觀霉素耐藥；蠟樣芽胞桿菌對氨芐西林、阿莫西林、羅紅霉素、大觀霉素耐藥；克雷伯菌對氨芐西林耐藥；蘇云金芽胞桿菌、Weihenstephanensis芽胞桿菌、Samanii芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌對氨芐西林、阿莫西林、大觀霉素耐藥，這些與其他家養(yǎng)動(dòng)物細(xì)菌耐藥情況有所不同［10-12］。

臨床中抗生素的使用，使細(xì)菌耐藥出現(xiàn)及蔓延，而赤腹松鼠在未給藥狀態(tài)下腸道部分細(xì)菌所產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)非抗生素誘導(dǎo)的結(jié)果。對于旅游景區(qū)而言，每個(gè)游客都是一個(gè)潛在的污染源，尤其一些缺乏生態(tài)環(huán)保意識的旅游者的不文明行為，給景區(qū)環(huán)境造成嚴(yán)重污染與破壞［13］。所產(chǎn)生旅游垃圾的成分比較復(fù)雜，大致可以分為兩類，即有機(jī)垃圾和無機(jī)垃圾，無機(jī)垃圾包括各類塑料制品和包裝物，還有口香糖、碎磚、石塊煤灰、煙頭、灰土、爐渣、廢紙等；有機(jī)垃圾包括畜禽糞便、動(dòng)物尸體、剩茶剩飯、瓜果皮核、菜根菜葉、魚肉骨頭、蛋殼和樹葉雜草等，以及由于沒有完善的旅游設(shè)施而在野外四處散布游客的糞便。當(dāng)活動(dòng)于旅游景區(qū)的赤腹松鼠與這些旅游垃圾接觸，可能將畜禽及人類具有耐藥基因細(xì)菌攝入體內(nèi)，細(xì)菌間耐藥基因（質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等）進(jìn)行轉(zhuǎn)移，使其它細(xì)菌獲得耐藥基因，這為赤腹松鼠在未給藥狀態(tài)下腸道部分細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的可能原因。

本研究以四川省某旅游景區(qū)的赤腹松鼠為對象，對赤腹松鼠所攜帶腸道細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果表明，赤腹松鼠腸道細(xì)菌種群具有多樣性，且存在致病菌，這為研究野生動(dòng)物是否攜帶致病菌提供了參考。在分離鑒定松鼠腸道菌群的基礎(chǔ)上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，赤腹松鼠腸道部分細(xì)菌具有耐藥性，這為進(jìn)一步研究細(xì)菌攜帶的天然耐藥基因以及耐藥傳遞機(jī)制提供了素材。同時(shí)也為旅游環(huán)境的保護(hù)，提出了警示和建議，為更好、更安全的發(fā)展以野生動(dòng)物為對象的休閑旅游娛樂活動(dòng)和森林旅游活動(dòng)提供一定的參考。

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