多殺性巴氏桿菌PurF蛋白的原核表達及多克隆抗體制備

張愛芹，郭東春，劉家森，原冬偉，姜 騫，林 歡，崔玉東，曲連東＊

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院，黑龍江大慶163319；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室 實驗動物研究室，黑龍江哈爾濱150001）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）作為巴氏桿菌屬最主要的代表菌，能夠引起多種動物感染，導致急性、敗血性傳染病，包括禽霍亂、牛出血性敗血癥、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎和兔出血性敗血癥。多殺性巴氏桿菌屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬革蘭陰性菌，主要以莢膜抗原和菌體抗原區(qū)分血清型。本菌呈世界性分布，給動物養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，被列為重點防控的疫病之一［1］。

purF基因編碼磷酸核糖焦磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶，該酶催化磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)化為磷酸核糖胺，是嘌呤核苷酸從頭合成的關(guān)鍵步驟。在大腸埃希菌中purF基因和cvpA基因與ubiX基因構(gòu)成一個操縱子，purF基因缺失突變株中嘌呤的合成量降低，而多磷酸激酶基因的表達量增加［2］。腸炎沙門菌的p-urF基因缺失突變株是嘌呤營養(yǎng)缺陷體，嘌呤或芳香族氨基酸等合成途徑的缺失突變體可作為疫苗用于細菌病原體的防控［3-4］。

應用DNA芯片技術(shù)對多殺性巴氏桿菌感染雞的血液中差異表達基因的篩選中，purF、purD、purH和purN都表達上調(diào)［5］。應用轉(zhuǎn)錄序列選擇性捕獲技術(shù)對多殺性巴氏桿菌感染兔肝臟組織，篩選到purF基因的表達水平是上調(diào)的［6］。應用信號標簽突變技術(shù)對多殺性巴氏桿菌毒力因子的鑒定中發(fā)現(xiàn)，purF基因缺失突變株對小鼠的致病性是減弱的［7］。傷寒沙門菌purF基因缺失突變株是減毒株，而都柏林沙門菌的purF基因缺失突變株毒力幾乎不降低［8］。恥垢分支桿菌purF基因編碼的蛋白與結(jié)核分支桿菌和麻風分支桿菌的PurF蛋白具有高度的同源性，能顯著地彌補缺氧表型菌株，而該菌的突變株在缺氧條件下生存能力降低［9］。PurF蛋白在不同種屬細菌致病中的作用不一致，而多殺性巴氏桿菌purF基因缺失突變株可能為減毒株，有作為基因工程疫苗預防巴氏桿菌病的潛力。

本研究應用原核系統(tǒng)表達兔多殺性巴氏桿菌C51-17株的PurF蛋白，免疫小鼠制備多克隆抗體，為進一步研究PurF蛋白在多殺性巴氏桿菌致病中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 多殺性巴氏桿菌C51-17株（A型）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸埃希菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)、pPROEX-HTa表達載體為中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物研究室保存。

1.1.2 實驗動物 6只清潔級Balb／c小鼠由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.1.3 主要試劑 EX-Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SpeⅠ等，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒，Promega公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒，增強型HRP-DAB底物顯色試劑，Tiangen公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG（H＋L）和辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠IgG（H＋L），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品；氨芐青霉素（Amp）濃度為100mg／L。

1.1.4 引物的設(shè)計與合成 參考GenBank（AE004439）登錄的序列，設(shè)計一對引物，上游引物pPurFE1：5′-CCCGAATTCATGTGTGGTATT-GTTGG-3′（下劃線為EcoRⅠ內(nèi)切酶位點），下游引物pPurFE2：5′-GGGACTAGTTTATTTTTCATTGTGCAT-3′（下劃線為SpeⅠ內(nèi)切酶位點），引物由博仕生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的制備 BHI瓊脂培養(yǎng)基挑取單 個 菌 落 于 裂 解 緩 沖 （10mmol／L Tris-HCl，0.5mol／L NaCl，1mmol／L EDTA，20g／L SDS）和終濃度為100μg／mL的蛋白酶K，置55℃水浴消化2h，冷至室溫后分別用酚／氯仿／異戊醇及氯仿抽提后，無水乙醇沉淀，最后用50μL雙蒸水溶解DNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 purF基因的擴增 以P.multocida C51-17基因組為模板，用引物pPurFE1／pPurFE2擴增purF基因，PCR反應體系（50μL）：10×EX Taq buffer 5.0μL，2.5μmol／L dNTPs 4.0μL，10μmol／L上、下游引物各1.0μL，EX-Taq DNA聚合酶0.5μL，無菌水36.5μL，模板2μL。PCR反應條件：94 ℃ 5min；94℃ 30s，50 ℃ 30s，72 ℃2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.3 原核表達載體的構(gòu)建 回收PCR產(chǎn)物，分別用EcoRⅠ／SpeⅠ雙酶切質(zhì)粒pPROEX-HTa和purF回收片段，雙酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后用T4DNA Ligase連接，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞。提取重組質(zhì)粒，酶切鑒定正確后的重組質(zhì)粒命名為pHT-purF，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 重組蛋白的表達及Western blot檢測 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pHT-purF轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3），挑單菌落培養(yǎng)過夜后按1∶100的比例接種于LB抗性（Amp＋）培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌液的OD 600nm達到0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.1mmol／L，37℃誘導表達5h，表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析。將誘導的和非誘導的重組菌經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，50g／L脫脂牛奶封閉2h，以制備的滅活的C51-17菌體免疫的兔血清為一抗（1∶100稀釋），37℃孵育1h，以HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋）為二抗，37℃孵育1h，DAB顯色，同時以未誘導菌株作為對照。

1.2.5 多克隆抗體的制備 將大量誘導表達的重組菌經(jīng)超聲波破碎，收集沉淀進行SDS-PAGE電泳，切下目的蛋白所在膠條，研磨，用適量PBS重懸，免疫注射8周齡左右的Balb／c小鼠，間隔2周免疫注射1次，共3次，三免后2周經(jīng)眼眶靜脈叢收集血液，分離血清。

1.2.6 ELISA檢測多克隆抗體效價 以重組蛋白包被酶標板，10μg／mL，4℃包被過夜；PBST洗滌3次后加入含1∶3 000稀釋的BL21（DE3）兔源陽性血清的5%脫脂乳作為封閉液，100μL／孔，37℃封閉2h；PBST洗滌3次后加入從1∶1 000開始倍比稀釋的PurF多克隆抗體，對照組為相同稀釋倍數(shù)的小鼠陰性血清，100μL／孔，37℃孵育1h；PBST洗滌3次后加入1∶20 000稀釋的HRP標記的山羊抗鼠IgG，100μL／孔，37℃孵育1h；PBST洗滌3次后每孔加入100μL新鮮配置的TMB顯色液，37℃暗反應10min后每孔加入50μL 2mol／L H2SO4終止反應；最后于450nm波長下測定吸光度值［10］。

1.2.7 Western blot檢測 用多殺性巴氏桿菌C51-17菌體和purF基因缺失突變株進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，以制備的多克隆抗體為一抗（1∶100稀釋），二抗為1∶5 000稀釋的HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體。

2 結(jié)果

2.1 purF基因片段的PCR擴增結(jié)果

以多殺性巴氏桿菌C51-17的DNA為模板，特異性擴增purF片段，產(chǎn)物經(jīng)10g／L的瓊脂糖凝膠電泳，擴增片段約為為1 500bp，與預期大小相符（圖1）。

2.2 重組表達載體的鑒定結(jié)果

將回收的PCR產(chǎn)物和pPROEX-HTa載體進行EcoRⅠ／SpeⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，連接轉(zhuǎn)化，隨機挑取單菌落提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，證明重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pHT-purF（圖2）。將陽性重組子進行測序分析，再次證實插入片段序列正確，全長為1 515bp。

圖1 purF基因擴增結(jié)果Fig.1 PCR products of purF gene

圖2 重組質(zhì)粒pHT-purF酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant pHT-purF by restricted endonuclease enzyme digestion

2.3 重組蛋白的表達和Western blot檢測

將重組表達質(zhì)粒pHT-purF轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），用0.1mmol／L IPTG誘導細菌，菌體裂解產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，重組蛋白PurF在分子質(zhì)量約56.5ku處有特異性蛋白條帶，與預期分子質(zhì)量大小一致，融合蛋白主要以包涵體形式存在；Western blot檢測表明，重組蛋白可以與多殺性巴氏桿菌制備的陽性血清發(fā)生反應（圖3）。

圖3 SDS-PAGE和Western blot檢測鑒定PurF蛋白Fig.3 PurF protein detected by SDS-PAGE and Western blot

2.4 ELISA檢測多克隆抗體效價

用重組蛋白PurF免疫Balb／c小鼠后，分離血清獲得PurF蛋白的多克隆抗體，通過ELISA檢測多克隆抗體效價為1∶128 000（圖4）。

2.5 多克隆抗體的制備和檢測

Western blot檢測表明該多克隆抗體能與多殺性巴氏桿菌C51-17菌體的PurF蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，而與purF基因缺失突變株沒有印跡條帶，表明purF基因缺失突變株構(gòu)建成功（圖5）。

圖4 ELISA法測定PurF多克隆抗體效價Fig.4 Determination of antibody titer

圖5 Western blot檢測purF基因缺失突變株Fig.5 Western blot analysis of purF mutant

3 討論

本實驗室鑒定出purF基因在多殺性巴氏桿菌感染的兔肝臟組織中表達是上調(diào)的［6］，信號標簽突變技術(shù)也證實purF基因缺失突變株對小鼠的致病性是減弱的［7］。因此本實驗室構(gòu)建多殺性巴氏桿菌purF基因缺失突變株，驗證PurF蛋白在構(gòu)建的purF基因缺失突變株中的表達水平。

本研究采用原核表達系統(tǒng)表達融合蛋白His-PurF蛋白，在分子質(zhì)量約56.5ku處有特異性印跡條帶，融合蛋白主要以包涵體形式存在；Western blot檢測表明，重組蛋白可以與多殺性巴氏桿菌制備的陽性血清發(fā)生反應，具有良好的抗原性。在試驗設(shè)計之初擬采用His親和層析純化融合蛋白，但在純化蛋白過程中，實際操作未能達到預期的目的，因此，在多抗的制備中，采用了切膠獲得PurF蛋白，免疫Balb／c小鼠制備多克隆抗體。而報道中切膠免疫的方法可以滿足抗體制備的要求，并且具有簡單易行，快速，保持蛋白的完整性，包涵體蛋白無需復性，無需乳化蛋白等優(yōu)點［11-14］。ELISA檢測表明，制備的PurF蛋白多克隆抗體的效價可達到1∶128 000；Western blot檢測表明，PurF蛋白位置上purF突變體中沒有蛋白信號，在野生型菌株中有信號，表明該鼠抗血清能特異識別巴氏桿菌中的PurF蛋白。

本研究利用原核系統(tǒng)表達了多殺性巴氏桿菌C51-17株的purF基因，并制備了鼠抗PurF多克隆抗體，該抗體具有較高的效價。利用制備的鼠抗PurF多克隆抗體對多殺性巴氏桿菌野生型菌株和purF基因缺失突變株進行Western blot檢測，purF基因缺失突變株中不表達PurF蛋白，驗證成功的構(gòu)建了purF基因缺失突變株。構(gòu)建的多殺性巴氏桿菌purF基因缺失突變株為下一步驗證PurF蛋白在細菌致病中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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