中藥對(duì)腎臟足細(xì)胞細(xì)胞骨架及裂孔隔膜相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展＊

王 竹 孫萬森 吳喜利 李睿萍 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院（西安710003）

腎小球內(nèi)有三種固有細(xì)胞：系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞。不同的病因可導(dǎo)致不同固有細(xì)胞的損傷，在臨床上表現(xiàn)為不同類型的腎小球疾病。其中足細(xì)胞受損后，臨床主要表現(xiàn)為蛋白尿。蛋白漏出是腎小球疾病的常見表現(xiàn)，反過來也是加速腎小球硬化的一個(gè)重要因素。近年來對(duì)足細(xì)胞生物學(xué)研究的深入，足細(xì)胞已被認(rèn)為是參與各種原發(fā)或繼發(fā)性腎小球疾病進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞。本文對(duì)近5來中醫(yī)藥對(duì)足細(xì)胞的治療研究進(jìn)行匯總，希望為中醫(yī)藥對(duì)足細(xì)胞的研究提供思路。

1 足細(xì)胞特性

1.1 足細(xì)胞生理結(jié)構(gòu) 足細(xì)胞位于腎小球基底膜（GBM）的最外層，呈多突狀。按結(jié)構(gòu)和功能不同分為三個(gè)部分：細(xì)胞體、主突和足突。其中，主突的微管連接著以肌動(dòng)蛋白為主的足突中的細(xì)胞骨架系統(tǒng)來維持和改變足細(xì)胞的形態(tài)，調(diào)節(jié)足突的運(yùn)動(dòng)。足突膨大如足，相鄰足細(xì)胞的足突交叉形成裂孔隔膜（slit diaphragm，SD），成為腎小球?yàn)V過膜的最后屏障。在基底膜和相鄰的毛細(xì)血管上，足細(xì)胞通過分布再其表面的整合素與細(xì)胞骨架緊密連接。足細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu)決定了其獨(dú)特的功能：①蛋白濾過的分子屏障；②蛋白濾過的電荷屏障；③抵抗腎小球內(nèi)壓力；④保證腎小球毛細(xì)血管袢的結(jié)構(gòu)；⑤合成維持腎小球基底膜完整的成分；⑥合成分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，維持腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能的完整性［1］。所以，當(dāng)足細(xì)胞損傷時(shí)，會(huì)出現(xiàn)足細(xì)胞脫失，血管壁塌陷，系膜細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)沉積等表型改變，最終導(dǎo)致腎小球的硬化。在上述過程中，主要表現(xiàn)為裂孔隔膜和足細(xì)胞骨架的異常。

1.2 足細(xì)胞骨架 骨架結(jié)構(gòu)不僅賦予足細(xì)胞一定的形狀，而且在其運(yùn)動(dòng)、信號(hào)傳導(dǎo)、能量傳遞等方面均起著重要作用，它是足細(xì)胞發(fā)揮正常功能的基礎(chǔ)。在腎小球?yàn)V過中，足細(xì)胞能通過自身結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)，而應(yīng)對(duì)如毛細(xì)血管張力、濾過液流經(jīng)足突時(shí)產(chǎn)生的流體剪切力等外力作用，從而維持腎小球正常的濾過率。當(dāng)足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)在病理?xiàng)l件下無法進(jìn)行適應(yīng)性改變時(shí)，即出現(xiàn)足細(xì)胞損害，甚至脫落，最終引起蛋白尿。

1.3 裂孔隔膜（slit diaphragm，SD） 在正常腎小球GBM上皮側(cè)，兩相鄰足突間有一個(gè)裂隙，此裂隙由一層薄膜連接，即裂孔隔膜。裂孔隔膜其外觀呈拉鏈樣，為蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。裂孔隔膜上的孔徑大小為40×140A，因與血清白蛋白的尺寸相似，所以被認(rèn)為很可能是血漿蛋白的主要濾過屏障。近年來，在裂空隔膜上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)由足細(xì)胞表達(dá)的SD 分子，如：nephrin、podocin、CD2AP（CD2－as－sociated protein）等，他們的改變對(duì)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能重要意義。

2 中藥對(duì)足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響 覃志成等［2］觀察黃芪對(duì)AngII誘導(dǎo)人足細(xì)胞分泌IV 膠原的影響，發(fā)現(xiàn)黃芪注射液可以通過抑制AngII誘導(dǎo)的足細(xì)胞分泌IV 膠原增高而減輕腎小球的損傷。謝輝等［3］使用降糖保腎方對(duì)早期糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激與超微結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)中，通過電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)中藥組大鼠足細(xì)胞足突融合較糖尿病組大鼠明顯減輕。陳姝君等［4］通過尿毒清顆粒對(duì)糖尿病大鼠足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究發(fā)現(xiàn)，尿毒清顆粒可以減輕足細(xì)胞病理改變，降低足突寬度，減輕足突融合程度，維持裂孔膜結(jié)構(gòu)，可以上調(diào)足細(xì)胞相關(guān)蛋白分子nephrin、podocin 的表達(dá)，維持二者在裂孔膜的線性分布。袁軍等［5］用溫陽活血利水方對(duì)阿霉素腎病大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究后，電鏡觀察到模型組腎小球足突融合嚴(yán)重；中藥組腎小球基膜平滑，未見增厚，足突融合程度與模型組比較減輕。徐洪燕等［6］通過益腎膠囊對(duì)糖尿病腎病模型腎小球足細(xì)胞的觀察，發(fā)現(xiàn)光鏡下模型組大鼠腎小球系膜基質(zhì)增多，系膜區(qū)增寬；電鏡下模型組大鼠腎小球基底膜增厚，足細(xì)胞排列紊亂，數(shù)目減少，足突增寬、融合。苯那普利組及益腎膠囊組腎小球基底膜病變減輕，細(xì)胞外基質(zhì)減少，足細(xì)胞數(shù)目增多，足突融合減輕。

3 中藥對(duì)足細(xì)胞相關(guān)蛋白的影響

3.1 Nephrin Nephrin由NPHS1基因編碼，是一種新的免疫球蛋白超家族的跨膜成分，其細(xì)胞外部分為8個(gè)免疫球蛋白基序和一個(gè)Ⅲ型纖維連接蛋白區(qū)域，細(xì)胞內(nèi)部分包括8個(gè)酪氨酸，提示Nephrin亦是一種信號(hào)黏附分子［7］。常沁濤等［8］在百齡膠囊對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織足細(xì)胞Nephrin表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)通過RT－PCR檢測(cè)大鼠腎組織Nephrin的表達(dá)，經(jīng)百令膠囊治療后，大鼠腎組織NephrinmRNA 的表達(dá)顯著上調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。推測(cè)百令膠囊可能通過上調(diào)Nephrin表達(dá)，減輕DN 的腎臟病理損傷，延緩腎臟病進(jìn)展發(fā)揮治療作用。在鄭佳新等［9］人對(duì)芪螻顆粒對(duì)阿霉素模型腎病大鼠腎小球足細(xì)胞NephrinmRNA 表達(dá)的影響中發(fā)現(xiàn)芪螻顆粒上調(diào)腎小球足細(xì)胞NephrinmRNA 表達(dá)，與模型組相比P＜0 01。任艷蕓等［10］通過祛風(fēng)通絡(luò)方對(duì)阿霉素腎病大鼠腎小球足細(xì)胞nephrinmRNA 表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，模型成功時(shí)，透射電鏡示AN 大鼠腎小球足突呈部分或彌漫性融合。7周時(shí)與模型組相比，祛風(fēng)組和激素組nephrin蛋白的熒光分布呈連續(xù)性或斑片狀分布，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)（P＜0.01）；祛風(fēng)組和激素組nephrinmRNA 的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）。推斷祛風(fēng)通絡(luò)方可上調(diào)AN 大鼠足細(xì)胞nephrin的表達(dá)和分布而起保護(hù)腎小球?yàn)V過屏障的作用。鐘娟等［11］人用腎康丸對(duì)早期糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞Nephrin表達(dá)進(jìn)行觀察，油鏡放大發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組足細(xì)胞nephrin陽性顯色明顯，腎康丸組陽性顯色明顯減少。通過半定量分析顯示：腎康丸組與模型對(duì)照組比較，腎小球nephrin陽性面積百分比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；腎康丸和厄貝沙坦合用組與模型對(duì)照組比較，腎小球nephrin陽性面積百分比仍有顯著性差異。鄭佳新等［12］人對(duì)五重散對(duì)C－BSA 腎炎大鼠腎小球足細(xì)胞NephrinmRNA 表達(dá)的影響的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，五重散對(duì)C－BSA 腎炎大鼠腎小球足細(xì)胞NephrinmRNA 能夠上調(diào)。

3.2 Podocin Podocin是脂質(zhì)筏相關(guān)蛋白（lipid raft－associated proteins）stomatin家族的新成員，分子量42kD。通過電鏡發(fā)現(xiàn)podocin 面對(duì)裂孔隔膜，兩末端插于足突的胞質(zhì)中［13］。同時(shí)Podocin與nephrin和CD2AP相互作用，作為支架蛋白對(duì)于裂孔隔膜結(jié)構(gòu)和功能的維持起著重要作用。袁軍等［5］用溫陽活血利水方對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的腎病大鼠腎小球足細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)溫陽活血利水方能使腎組織中PodocinmRNA 與蛋白表達(dá)減少，改善其腎組織的病理改變。這可能是溫陽活血利水方減少蛋白尿的重要作用機(jī)制。

3.3 CD2AP CD2AP（CD2－associatedprotein）可與nephrin的胞質(zhì)區(qū)結(jié)合，推測(cè)其作用可能是連接裂孔隔膜與足細(xì)胞的細(xì)胞骨架，維持腎小球?yàn)V過屏障正常的結(jié)構(gòu)。CD2AP 是跨膜蛋白，分子量為80kD，屬于免疫球蛋白超家族。林麗等［14］通過建立阿霉素（ADR）腎病模型，用蟾蜍等干預(yù)后，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察各組模型大鼠腎小球中CD2AP 的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)蟾蜍能使腎小球足細(xì)胞CD2AP的表達(dá)上調(diào)。

3.4 desmin 結(jié)蛋白（desmin）屬于細(xì)胞骨架的中間絲蛋白。正常情況下，足細(xì)胞主要表達(dá)中間絲蛋白波形蛋白vimentin，而結(jié)蛋白主要在系膜細(xì)胞表達(dá)。當(dāng)足細(xì)胞因各種原因發(fā)生損傷時(shí)，可大量表達(dá)結(jié)蛋白。陳繼紅等［15］用大黃蟄蟲丸對(duì)阿霉素腎病大鼠足細(xì)胞骨架蛋白desmin表達(dá)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組比較，阿霉素腎病大鼠腎小球內(nèi)desmin蛋白表達(dá)上調(diào)，足細(xì)胞部分足突融合。大黃蟄蟲丸可明顯減輕阿霉素腎病大鼠腎小球內(nèi)desmin蛋白的表達(dá)，減輕足細(xì)胞足突融合，降低尿白蛋白排泄率。鐘娟等［11］實(shí)驗(yàn)觀察腎康丸對(duì)早期糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞desmin表達(dá)的影響，光鏡放大觀察，腎康丸組陽性顯色較模型對(duì)照組足細(xì)胞desmin陽性顯色明顯減少。半定量分析顯示：腎康丸組、腎康丸和厄貝沙坦合用組與模型對(duì)照組比較，腎小球desmin陽性面積百分比有顯著性差異。推測(cè)腎康丸可通過調(diào)節(jié)DN 時(shí)足細(xì)胞desmin表達(dá)而維護(hù)足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)揮減少尿蛋白、延緩DN 進(jìn)展的作用。

可以看出，當(dāng)前對(duì)腎臟足細(xì)胞的細(xì)胞骨架及裂孔膜相關(guān)蛋白的研究取得了一些成果，但文獻(xiàn)報(bào)告的整體數(shù)量并不多，說明對(duì)其的研究還處于起步階段。中藥與復(fù)方雖都有研究，但中藥的研究數(shù)量明顯低于復(fù)方，特別是中藥的單體成分對(duì)足細(xì)胞細(xì)胞骨架及相關(guān)蛋白影響的實(shí)驗(yàn)研究還很少。從研究的質(zhì)量上看，僅限于對(duì)某一相關(guān)蛋白的定量分析，未能對(duì)幾個(gè)蛋白的相關(guān)性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，比如說是否在某一蛋白改變的情況下，其余蛋白也有相應(yīng)改變等等。研究的熱點(diǎn)集中Nephrin蛋白較多，而其余的蛋白相對(duì)研究較少。總之，中醫(yī)藥對(duì)足細(xì)胞骨架及裂孔膜相關(guān)蛋白的研究還在起步階段，從切入點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)方法上來看還有很大的空間，需要我們進(jìn)一步努力。

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