參術(shù)膠囊對脾虛胃癌小鼠T細(xì)胞活化信號的影響

鄧青秀，彭 成，敖 慧，謝曉芳

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075)

參術(shù)膠囊處方來源于《證治準(zhǔn)繩》中治療脾氣虛證之“參術(shù)膏”。實(shí)驗(yàn)研究表明參術(shù)膠囊能明顯改善瘤細(xì)胞的異型性，并能通過調(diào)控與代謝、離子通道和運(yùn)輸?shù)鞍椎认嚓P(guān)基因來發(fā)揮治療脾虛胃癌轉(zhuǎn)移鼠［1－2］。機(jī)體的免疫功能狀態(tài)與脾虛胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。因此，本研究以誘發(fā)性脾虛胃癌小鼠為模型，觀察參術(shù)膠囊對脾虛胃癌小鼠T細(xì)胞活化信號的影響，進(jìn)一步明確參術(shù)膠囊抗腫瘤作用的分子機(jī)制和作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 免疫組化一抗:MHC-Ⅰ大鼠抗小鼠IgG(英國ABCAM公司，貨號:ab15681)，MHC-Ⅱ大鼠抗小鼠(美國MILLIPORE公司，批號:NRG1810099)，B7-1兔抗大鼠IgG(北京博奧深公司，批號909002W)，CD4兔抗大鼠IgG(北京博奧深公司，批號:900283W)，CD8兔抗大鼠IgG(北京博奧深公司，批號900280W)，SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號:11888800)，堿磷酶底物AP-Red試劑盒(北京中衫金橋有限公司，批號:P106723C)，顯色劑 DAB(武漢博士德生物工程有限公司，批號:112452Q)。電子天平PA2003(上海天平儀器廠)，Olympus-BX50光學(xué)顯微鏡(日本)。

1.2 藥物 參術(shù)膠囊(由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，由紅參皂苷、白術(shù)油、紅參白術(shù)復(fù)合多糖，每g提取物含10 g原生藥，批號20080401)，胃復(fù)春片(杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司，0.359克/片，批號:20090712)，山西白醋(山西老陳醋集團(tuán)有限公司，標(biāo)準(zhǔn)代號:GB18187.2000)，N-亞硝基二乙胺(DENA)(日本TCI公司，批號:BW03821)。

1.3 誘發(fā)性脾虛胃癌模型的制備 KM小鼠，♀♂各半，體質(zhì)量22～26 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供［SPF級，許可證號SCXK(川)2008-11］。按體重隨機(jī)取17只小鼠作為空白組，其余按以下方法造模:禁食24 h后首日給予山西白醋 15 ml·kg－1·d－1，次日給予 10 ml·kg－1·d－1灌胃，連續(xù)9 d，d 10給予 N-亞硝基二乙胺(DENA)按2.8 mg·kg－1·d－1灌胃，連續(xù) 110 d。

1.4 動物分組和處理 將剩余的227只小鼠隨機(jī)分成5組，其中模型組56只，陽性組51只，高劑量組46只，中劑量組34只，低劑量組40只，其中模型組不予處理，陽性組按718 mg·kg－1·d－1灌胃給藥胃復(fù)春片，高劑量組按參術(shù)膠囊 440 mg·kg－1·d－1，中劑量組按 220 mg·kg－1·d－1，低劑量組按110 mg·kg－1·d－1灌胃給藥，連續(xù)30 d。每隔 10 d測量體重、5 min自發(fā)活動、觀察脾虛表現(xiàn)(飲水量、自發(fā)活動數(shù)、精神狀態(tài)，有無便溏、腹脹、聳毛、瞇眼等)。治療30 d后稱取小鼠重量，再脫頸椎處死小鼠，取胃于10%福爾馬林固定，石蠟包埋、切片、HE染色，鏡下觀察胃組織切片的變化。每組隨機(jī)取10只動物標(biāo)本，按免疫組化SABC法操作流程進(jìn)行，漿或膜呈棕黃色－黃色表達(dá)為陽性。采用OlympusBX50顯微鏡，在40×10倍光學(xué)顯微鏡下，用泰盟 BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)將免疫組化圖像采集，半定量分析表達(dá)情況。每張切片(每例動物標(biāo)本)隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性(表達(dá))細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以±s表示，用單因素方差分析法進(jìn)行組間差異顯著性分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)表現(xiàn) 脾虛胃癌模型組在實(shí)驗(yàn)過程中動物出現(xiàn)不同程度的脾虛表現(xiàn)，小鼠毛色灰暗、失去光澤、形體瘦弱、行動遲緩、精神萎靡不振、攝食量和飲水量減少。用藥30 d后，參術(shù)膠囊高、中、低劑量組均能明顯提高模型動物的存活率、體重及5 min自發(fā)活動數(shù)。

2.2 胃組織病理表現(xiàn) 胃癌模型組組織結(jié)構(gòu)紊亂，呈浸潤性生長，與周圍組織分界不清，癌細(xì)胞中等偏大，呈圓形、橢圓形、多邊形及不規(guī)則形，胞質(zhì)較少，核染色較深，呈橢圓形、三角形及不規(guī)則形，數(shù)呈空泡形，核分裂象較多，核仁粗大，位于核中或偏位，多數(shù)具有一個(gè)核仁，少數(shù)有兩個(gè)或者以上染色深。用藥30d后，胃復(fù)春片組、參術(shù)膠囊高、中、低劑量均能明顯減輕病理改變。

2.3 參術(shù)膠囊對誘發(fā)性脾虛胃癌模型T細(xì)胞活化信號的影響 模型組胃組織表達(dá)的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7-1、CD4、CD8陽性細(xì)胞數(shù)均低于正常組。胃復(fù)春片組和參術(shù)膠囊高劑量組均能明顯增加模型動物胃組織 MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7-1、CD4、CD8的表達(dá)(P＜0.05)。參術(shù)膠囊低劑量組MHC-Ⅰ、B7-1、CD4、CD8陽性細(xì)胞數(shù)較模型增加明顯(P＜0.05)，MHC-Ⅱ表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)較模型有增加趨勢。參術(shù)膠囊中劑量組能明顯增加模型動物MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7-1、CD4的表達(dá)(P＜0.01)，CD8表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)有增加趨勢。

Tab 1Effect of Shenshu capsules on T activation signals of spleen-deficient gastric cancer mice(±s，n=10)

Tab 1Effect of Shenshu capsules on T activation signals of spleen-deficient gastric cancer mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs model

Group Dosage/mg·g－1 Cell counts of MHC-Ⅰpositivity Cell counts of MHC-Ⅱpositivity Cell counts of B7-1 positivity Cell counts of CD4 positivity Cell counts of CD8 positivity Control group － 2.30 ±1.25 2.50 ±1.27 2.80 ±2.20 3.00 ±1.49 2.40 ±0.52 Model group － 0.60 ±0.70* 0.90 ±0.88 0.40 ±0.52 0.20 ±0.63＊＊ 0.70 ±1.16*Weifuchun group 0.718 1.90 ±0.74△ 4.70 ±1.95△△ 3.30 ±1.16△△ 2.40 ±1.43△ 4.10 ±1.29△△Low dosage group 0.110 2.10 ±1.10△ 1.90 ±0.57 3.30 ±1.06△△ 3.30 ±0.82△△ 2.20 ±0.79△Middle dosage group 0.220 12.60 ±6.42△△ 6.20 ±1.55△△ 3.90 ±0.74△△ 8.10 ±3.98△△ 1.80 ±0.42 High dosage group 0.440 4.40 ±1.43△△ 6.30 ±1.34△△ 3.20 ±1.48△△ 6.20 ±3.49△△ 4.40 ±1.51△△

3 討論

細(xì)胞表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子的弱表達(dá)與丟失，導(dǎo)致免疫細(xì)胞的應(yīng)答無能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視和逃逸特異性CTL抗腫瘤免疫應(yīng)答的重要機(jī)制［3－4］。中藥藥理研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，許多中藥在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面獨(dú)具優(yōu)勢［5－8］。本研究發(fā)現(xiàn)，脾虛胃癌模型胃組織內(nèi) CD4、CD8、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7-1 表達(dá)下調(diào)，T 細(xì)胞活化信號減弱，使T細(xì)胞處于無能狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。經(jīng)參術(shù)膠囊治療后，能明顯改善胃組織的病理變化，上調(diào)胃組織內(nèi) CD4、CD8、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7-1 的表達(dá)。說明參術(shù)膠囊是通過增強(qiáng)T細(xì)胞活化雙信號T細(xì)胞受體(TCR)與抗原肽—MHC復(fù)合物和共刺激分子B7-1的表達(dá)，使T細(xì)胞活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)借助于CD3分子及CD4/CD8分子和CD28等分子的輔助，將胞外刺激信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)部，使轉(zhuǎn)錄因子活化，轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，活化相關(guān)基因。

CD8+T細(xì)胞的激活不同于CD4+T細(xì)胞的激活。CD8+T細(xì)胞作用的靶細(xì)胞一般低表達(dá)或不表達(dá)協(xié)同刺激分子，不能有效激活初始CD8+T細(xì)胞，而需要CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2等細(xì)胞因子的輔助增殖，才能分化為CD8+T細(xì)胞，本研究發(fā)現(xiàn)參術(shù)膠囊有可能通過增強(qiáng)CD4+T的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的活性，并通過細(xì)胞凋亡和細(xì)胞裂解機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制脾虛胃癌的發(fā)生發(fā)展。

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