氫化可的松對(duì)酮康唑經(jīng)大鼠皮膚透過(guò)性的影響

蘇碧雅，李國(guó)鋒，熊璐琪，趙博欣

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州 510515)

糖皮質(zhì)激素類藥物能有效防治皮膚炎癥［1］，但是糖皮質(zhì)激素的濫用問(wèn)題已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，長(zhǎng)期使用會(huì)引起皮膚組織學(xué)的變化，皮膚變薄是長(zhǎng)期用藥產(chǎn)生的副反應(yīng)之一［2］，皮膚細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)基中加入糖皮質(zhì)激素14 d后，可引起表皮層細(xì)胞減少，同時(shí)觀察到皮膚萎縮，皮膚表皮層變薄，角質(zhì)細(xì)胞增殖受到抑制，真皮層膠原蛋白合成量減少［3］。目前受到廣泛關(guān)注的是糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期使用后引起皮膚改變及其機(jī)制，尚未見(jiàn)糖皮質(zhì)激素經(jīng)皮給藥后引起的組織學(xué)改變對(duì)其他藥物經(jīng)皮透過(guò)影響方面的研究，未見(jiàn)關(guān)于糖皮質(zhì)激素類藥物和其他經(jīng)皮給藥制劑聯(lián)合使用時(shí)相互作用的研究。本文選擇了氫化可的松這種代表性的糖皮質(zhì)激素進(jìn)行了這方面的研究。

1978年口服酮康唑片劑應(yīng)用于臨床，1981年2%酮康唑乳膏上市［4］。酮康唑具有廣泛的藥理學(xué)作用，有多種適應(yīng)證，但酮康唑具有明顯的肝臟毒性［5］，口服給藥后肝臟毒性明顯，所以局部體表真菌感染一般會(huì)選擇外用酮康唑。因此，本文在評(píng)價(jià)正常皮膚和使用氫化可的松皮膚兩周后大鼠皮膚透過(guò)性差異實(shí)驗(yàn)中，選擇了酮康唑這種常用的抗真菌藥物作為評(píng)價(jià)藥物。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 日本島津LC-20A高效液相色譜儀，SPD-20AT檢測(cè)器;TK-20A型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司);Thermo Scientific Sorvall Legend Mach 1.6/R臺(tái)式離心機(jī)(上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司);PB110S電子天平(德國(guó)Sartorins公司);HWS-26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司);松下電動(dòng)剃毛刀等。

1.2 試劑 酮康唑?qū)φ掌?中檢所，批號(hào)100294-200602)，酮康唑原料藥(純度≥99%，廣州越迪化工有限公司分裝)，氫化可的松對(duì)照品(Sigma公司)，氫化可的松原料藥 (純度≥99.3%，深圳市益飛商貿(mào)有限公司)。高效液相試劑甲醇為色譜純，水為雙蒸去離子水，乳膏基質(zhì)輔料等其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物 正常SPF級(jí)♂ Wistar大鼠，體質(zhì)量(250±10)g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(粵)2006-0015。實(shí)驗(yàn)期間給予普通飼料和清潔飲水。

2 方法

2.1 氫化可的松乳膏劑的配制(1%含藥量) 處方:氫化可的松原料藥10 g，硬脂酸100 g，單硬脂酸甘油酯50 g，液體石蠟140 ml，白凡士林50 g，甘油50 g，十二烷基硫酸鈉(SDS)1 g，三乙醇胺3.5 g，蒸餾水616 ml。配制步驟:將上述藥物水相和油相分別加熱至80℃(水相溫度略高于油相)，將水相緩緩加入油相中，按同一方向隨加隨攪拌，繼續(xù)攪拌冷卻至60℃左右時(shí)，將此混合液逐步加入到氫化可的松的甘油糊狀物中，仍按同一方向隨加隨攪拌，冷凝后停止攪拌，即得，共制成1 000 g。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 12只Wistar♂大鼠，體質(zhì)量(250±10)g，隨機(jī)分為2組，每組6只，分別為對(duì)照組(Control group)和氫化可的松組(HC group)。大鼠固定后，用剃須刀將腹部毛剃除干凈，兩組分別涂空白乳膏或氫化可的松乳膏(劑量為2 g·d-1)，給藥面積約6 cm2(2 cm×3 cm)，涂藥后大鼠仰躺固定以防大鼠舔食乳膏，2 h后用脫脂棉蘸生理鹽水除去腹部殘留乳膏，清潔腹部皮膚，放回鼠籠，每天給藥1次，連續(xù)給藥2周。

2.3 酮康唑經(jīng)氫化可的松組和空白乳膏組大鼠皮膚體外透皮實(shí)驗(yàn)

2.3.1 酮康唑乳膏的制備(2%含藥量) 處方:酮康唑原料藥20 g，硬脂酸100 g，單硬脂酸甘油酯50 g，液體石蠟 140 ml，白凡士林 50 g，甘油 50 g，十二烷基硫酸鈉(SDS)1 g，三乙醇胺3.5 g，蒸餾水616 ml。配制步驟:將上述藥物水相和油相分別加熱至80℃(水相溫度略高于油相)，將水相緩緩加入油相中，按同一方向隨加隨攪拌，繼續(xù)攪拌冷卻至60℃左右時(shí)，將此混合液逐步加入到酮康唑的甘油糊狀物中，仍按同一方向隨加隨攪拌，冷凝時(shí)停止攪拌，即得，共制成1 000 g。

2.3.2 體外Franz實(shí)驗(yàn) 取給藥2周后的大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(劑量30 mg·kg-1)，用脫脂棉沾生理鹽水擦干凈皮膚，取下鼠皮，放血處死動(dòng)物。小心的用沾有生理鹽水的脫脂棉除去皮下脂肪待用。取已處理好的大鼠腹部皮膚固定在擴(kuò)散池中，透皮擴(kuò)散有效內(nèi)徑為1.8 cm，接收室體積為6.5 ml，接收液為10%乙醇PBS(pH 7.4)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程(37.0±0.2)℃水浴，300 r·min-1攪拌。分別稱取酮康唑乳膏或空白乳膏(空白乳膏透過(guò)液用于方法學(xué)專屬性考察和酮康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制)2 g加于供應(yīng)室中，供應(yīng)室上用保鮮膜封口，防止水分蒸發(fā)。分別于 0.5、1、2、4、6、8、12 和 24 h 取樣 0.5 ml，同時(shí)補(bǔ)充相同體積相同溫度的新鮮接收液。樣品離心10 min(15 000 r·min-1)，取上清液注入HPLC測(cè)定酮康唑的濃度。

2.4 酮康唑HPLC檢測(cè)方法的建立

2.4.1 色譜條件 選用 ECOSIL C18色譜柱(5 μm，250×4.6 mmI.D.)，流動(dòng)相為甲醇 -0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(70∶30)(水相用0.01 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到6.8)，流速:1.0 ml·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm，柱溫35℃。

2.4.2 酮康唑?qū)φ掌穬?chǔ)備液配制 精密稱定酮康唑標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，置100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為200 mg·L-1的酮康唑甲醇儲(chǔ)備液。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將酮康唑?qū)φ掌穬?chǔ)備液逐一稀釋(稀釋溶劑為氫化可的松組皮膚給空白乳膏后的Franz透過(guò)液)，得質(zhì)量濃度分別為12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，注入HPLC測(cè)定峰面積，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 取12.5、3.13、0.10 mg·L-13個(gè)不同濃度的酮康唑標(biāo)準(zhǔn)品，每日重復(fù)測(cè)定3次，記錄峰面積，連續(xù)3 d，計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取酮康唑細(xì)粉適量，按低、中、高3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)加入到已知濃度的酮康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液中，超聲5 min溶解后定容，過(guò)濾。測(cè)樣品中酮康唑濃度，計(jì)算加樣回收率，加樣量見(jiàn)Tab 1。

2.5 酮康唑穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 酮康唑具有酰胺基和醚基結(jié)構(gòu)，容易氧化變質(zhì)［6］，因此本實(shí)驗(yàn)做了穩(wěn)定性研究。

2.5.1 氫化可的松用藥后的皮膚對(duì)酮康唑穩(wěn)定性的影響 取使用氫化可的松給藥2周后的大鼠腹部皮膚3份，每份約6 cm2，分別加生理鹽水多次研磨制成組織懸液，15 000 r·min-1離心15 min后取上清液，以該上清液為溶劑，配制12.5、3.13、0.10 mg·L-13個(gè)不同濃度的酮康唑溶液，每個(gè)濃度用不同皮膚懸液配3份，共9份，配制后0.5、12、24 h分別做HPLC檢測(cè)，計(jì)算配制濃度和實(shí)測(cè)濃度的差異性。

2.5.2 酮康唑標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性研究 取12.5、3.13、0.10 mg·L-13個(gè)不同濃度的酮康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別于配制后第 0、2、4、6、8、12 和 24 h 測(cè)定酮康唑峰面積，計(jì)算RSD。

2.6 自制乳膏劑藥物含量的測(cè)定

2.6.1 氫化可的松乳膏供試液的制備 精密稱取氫化可的松乳膏2 g(相當(dāng)于氫化可的松20 mg)，置燒杯中，加甲醇約30 ml，在水浴上加熱使溶解，再置冰水中冷卻，濾過(guò)，濾液置100 ml容量瓶中，如此提取3次，濾液并入量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心后注入液相色譜儀檢測(cè)［7］。按上述方法配制3份樣品，計(jì)算含量平均值和RSD。

2.6.2 酮康唑乳膏供試液的制備 酮康唑乳膏提取方法參照“2.6.1”，按上述方法配制3份樣品，計(jì)算平均值和RSD。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料結(jié)果用±s表示。正常組與HC組大鼠皮膚滲透速率比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Sample T Test，2-tailed)。

3 結(jié)果

3.1 HPLC方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性 分別取空白乳膏皮膚透過(guò)液、酮康唑?qū)φ掌啡芤汉? h酮康唑乳膏皮膚透過(guò)液做HPLC檢測(cè)，可見(jiàn)酮康唑保留時(shí)間約為9.5 min，分離良好(Fig 1)。

Fig 1 HPLC chromatograms of ketoconazole

3.1.2 線性范圍 測(cè)定質(zhì)量濃度分別為12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10、0.05 mg·L-1酮康唑溶液的峰面積，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=3e-5X-0.3102(r2=0.9999)，線性范圍為0.05～12.5 mg·L-1，線性良好。

3.1.3 精密度 取12.5、3.13、0.10 mg·L-13個(gè)不同濃度的酮康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每日重復(fù)測(cè)定3次，記錄峰面積，連續(xù)3 d，計(jì)算得日內(nèi)精密度和日間精密度的RSD均＜3.5%。

3.1.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取酮康唑細(xì)粉適量，按低、中、高3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)加入到已知濃度的酮康唑溶液中，超聲5 min溶解后用定容至刻度，過(guò)濾，做HPLC檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 The average recovery of ketoconazole(n=9)

3.2 酮康唑穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 氫化可的松用藥后的皮膚對(duì)酮康唑穩(wěn)定性的影響 計(jì)算得，9份樣品(實(shí)測(cè)濃度/配制濃度)×100%的范圍在95% ～105%之間，RSD＜4.684%，這說(shuō)明給藥后皮膚中殘留的氫化可的松和乳膏劑基質(zhì)對(duì)酮康唑HPLC檢測(cè)的干擾不影響檢測(cè)。

3.2.2 酮康唑標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性研究 取12.5、3.13、0.10 mg·L-13個(gè)不同濃度的酮康唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別于配制后第 0、2、4、6、8、12 和 24 h 測(cè)定酮康唑峰面積，計(jì)算所得RSD均＜1.56%，表明供試品溶液在室溫下穩(wěn)定性良好。

3.3 自制氫化可的松乳膏和酮康唑乳膏質(zhì)量檢查結(jié)果

3.3.1 主藥含量測(cè)定 自制氫化可的松乳膏劑中氫化可的松的平均含藥量為0.92%，RSD為0.7%，自制酮康唑平均含藥量為2.01%，RSD為3.2%。均符合藥典規(guī)定的90%～110%標(biāo)示量區(qū)間。

3.3.2 乳膏劑穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 稱取1 g乳膏加2 ml水5 000 r·min-1離心10 min后無(wú)分層現(xiàn)象。乳膏置于4℃保存1個(gè)月后沒(méi)有出現(xiàn)酸敗和異味。

3.4 Franz實(shí)驗(yàn)結(jié)果 測(cè)得的樣品藥物濃度按下列公式計(jì)算單位面積的累計(jì)透過(guò)量(permeated A-mount quantity，Q)

方程式中V:接受池的體積;Cn:第n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得藥物的濃度;A:有效擴(kuò)散面積(本實(shí)驗(yàn)中為2.5434 cm2);Ci:第i(i≤n-1)個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物濃度。對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)累計(jì)藥物透過(guò)量進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，其斜率即為藥物滲透速率(penetrating rate，PR，μg·h-1·cm-2)(Tab 2，F(xiàn)ig 2)?？瞻兹楦嘟M的滲透速率約為氫化可的松組的兩倍，兩組滲透速率差異有顯著性(P＜0.01)。

Tab 2 The PR of ketoconazole through different group rats’skin(±s，n=6)

Tab 2 The PR of ketoconazole through different group rats’skin(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs control group

Group PR/μg·cm-2·h -1 Control 0.730±0.042 HC 0.403±0.026＊＊

4 討論

在給藥實(shí)驗(yàn)中，需要設(shè)置空白乳膏對(duì)照組，因此借鑒了文獻(xiàn)中的處方，選用了自制HC乳膏劑，而非市售制劑，便于制作空白乳膏設(shè)立對(duì)照組進(jìn)行比較。在體外透過(guò)實(shí)驗(yàn)中，需要建立皮膚透過(guò)液中酮康唑的HPLC檢測(cè)方法，做專屬性考察，故依據(jù)有關(guān)資料，自擬了配方，也選用了酮康唑自制乳膏，便于做空白對(duì)照。經(jīng)質(zhì)量考察發(fā)現(xiàn)自制乳膏質(zhì)量合格，完全滿足實(shí)驗(yàn)需要。

糖皮質(zhì)激素類藥物的副作用是經(jīng)皮給藥制劑研究中很受關(guān)注的一部分，很多研究者也從各方面證實(shí)了糖皮質(zhì)激素類藥物的各種不良反應(yīng)及其產(chǎn)生機(jī)制，而較少關(guān)注糖皮質(zhì)激素類藥物引起的皮膚改變對(duì)合用藥物(或皮質(zhì)激素給藥后使用藥物)經(jīng)皮透過(guò)的影響。

Fig 2 The ketoconazole permeated amount(Q)-time curve chart

本文初步證實(shí)糖皮質(zhì)激素氫化可的松引起的皮膚改變會(huì)導(dǎo)致酮康唑經(jīng)皮透過(guò)量減少、滲透速率降低。查閱文獻(xiàn)表明為國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道。一般認(rèn)為，長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素后，其引起的皮膚變薄、脂肪萎縮可能造成透過(guò)量的增加，但我們發(fā)現(xiàn)了與預(yù)測(cè)相反的結(jié)果，有必要進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(如腹部給藥后取血檢測(cè)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，以及在體微透析實(shí)驗(yàn)等)來(lái)驗(yàn)證這種結(jié)果，以及通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來(lái)分析可能的機(jī)制等，有關(guān)工作我們正在進(jìn)行中。

選用常用的抗真菌藥酮康唑乳膏作為實(shí)驗(yàn)制劑，得到了有差異的結(jié)論，這說(shuō)明糖皮質(zhì)激素類藥物經(jīng)皮給藥一段時(shí)間引起的皮膚組織學(xué)改變確實(shí)能影響其他藥物的經(jīng)皮滲透和吸收過(guò)程。但本實(shí)驗(yàn)只采用了酮康唑作為實(shí)驗(yàn)藥物進(jìn)行了考察，糖皮質(zhì)激素類藥物經(jīng)皮給藥后引起的皮膚組織學(xué)改變對(duì)其他經(jīng)皮給藥制劑透過(guò)性的影響有待選定更多實(shí)驗(yàn)制劑后做進(jìn)一步考察，以證實(shí)這種影響是否具有普遍性。

連續(xù)使用氫化可的松乳膏2周后引起的皮膚改變會(huì)導(dǎo)致酮康唑經(jīng)皮透過(guò)量的減少，滲透速率降低?；颊咴陂L(zhǎng)期使用氫化可的松乳膏后再使用酮康唑經(jīng)皮給藥制劑時(shí)可能需考慮調(diào)整劑量，以保證藥物療效。

［1］李 鑫，楊 蕊，臧 強(qiáng)，等.糖皮質(zhì)激素的藥理作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2009，36(1):27-30.

［1］Li X，Yang R，Zang Q.Pharmacological actions of glucocorticoids:progress in mechanisms［J］.Int J Pharm Res，2009，36(1):27-30.

［2］李林峰.腎上腺糖皮質(zhì)激素類藥物在皮膚科的應(yīng)用［M］.北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2004:71.

［2］Li L F.The Application of glucocorticoid drugs in dermatology［M］.Beijing:Peking University Medical Press，2004:71.

［3］Z?ller N N，Kippenberger S，Thaci D，et al.Evaluation of beneficial and adverse effects of glucocorticoids on a newly developed fullthickness skin model［J］.Toxicol In Vitro，2008，22(3):747-59.

［4］王愛(ài)平，李若瑜.2%酮康唑乳膏在皮膚科疾病中的應(yīng)用［J］.中國(guó)真菌學(xué)雜志，2010，5(3):179-83.

［4］Wang A P，Li R Y.The application of 2%ketoconazole cream in dermatology［J］.Chin J Mycol，2010，5(3):179-83.

［5］逄曉云，劉曉琰，沈金芳.酮康唑致嚴(yán)重肝損1例［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29(18):1579.

［5］Pang X Y，Liu X Y，Shen J F.A case of serious liver injury caused by Ketoconazole［J］.Chin J Hospital Pharm，2009，29(18):1579.

［6］邢東志，邢 晗，寶 玲.復(fù)方酮康唑軟膏的處方設(shè)計(jì)試驗(yàn)［J］.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4(16):165.

［6］Xing D Z，Xing H，Bao L.The formulation design of compound ketoconazole ointment［J］.Chin J Mod Drug Applic，2010，4(16):165.

［7］鄭一美，駱光亙.不同乳化劑對(duì)酮康唑乳膏含量測(cè)定影響的研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25(7):653-4.

［7］Zheng Y M，Luo G G.Study on determination of ketoconazole with different emulsifier in its cream［J］.Chin J Mod Appl Pharm，2008，25(7):653-4.