5-羥色胺1A受體激動(dòng)劑高通量篩選模型的建立

孫 穎，蔡海燕，沈敬山，朱維良，王賀瑤，郭敏亮

(1.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009;2.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203)

抑郁癥目前已成為世界第4大疾患，到2020年可能成為僅次于心臟病的第2大疾?。?］。研究表明，抑郁癥主要是由于生活壓力、基因遺傳和一些易感因素所導(dǎo)致的［2］。國(guó)內(nèi)外報(bào)道抑郁癥患者中50% ～85%可反復(fù)發(fā)作，每年有15%的抑郁癥患者自殺［3］，因此抑郁癥正成為全球公共健康中的一大主要問(wèn)題。

5-HT1A受體是5-HT受體家族中第1個(gè)被克隆出來(lái)的亞型。人類遺傳學(xué)和圖像學(xué)研究表明5-HT1A受體與焦慮癥、抑郁癥、精神分裂癥等一系列精神疾病有關(guān)，目前臨床研究表明，其激動(dòng)劑能有效改善抑郁癥和焦慮癥［4］。因此，開(kāi)發(fā)和尋找5-HT1A受體的激動(dòng)劑具有重要意義，而構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)人源5-HT1A受體是該受體激動(dòng)劑篩選的重要方法和手段。

由于5-HT1A受體在胞內(nèi)可以調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路，針對(duì)5-HT1A受體建立穩(wěn)定細(xì)胞株的方法中目前主要有胞內(nèi)鈣信號(hào)和cAMP水平的測(cè)定［5］。本研究采用化學(xué)發(fā)光的方法測(cè)定胞內(nèi)cAMP的水平以建立可用于高通量篩選5-HT1A受體激動(dòng)劑的細(xì)胞模型。通過(guò)對(duì)模型建立過(guò)程中工具細(xì)胞、共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒比例及化合物孵育時(shí)間等方面進(jìn)行優(yōu)化，確定模型建立的最佳條件。同時(shí)，為了驗(yàn)證化合物在穩(wěn)定細(xì)胞株上的表現(xiàn)活性，實(shí)驗(yàn)針對(duì)幾種經(jīng)典的5-HT1A受體激動(dòng)劑展開(kāi)了相應(yīng)的研究。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 質(zhì)粒抽提試劑盒(QIAGEN公司);pcDNA3.1-h5-HT1A受體質(zhì)粒和pcDNA3.1-pCRE-luc質(zhì)粒(Stratagene公司);Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑(Roche公司);8-OH-DPAT(Tocris公司);Forskolin(Sigma公司);Steady-glo(Promega公司)。

1.2 主要儀器 Flex Station 3酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);電泳設(shè)備(上海天能科技有限公司);冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司);倒置顯微鏡(Olympus公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)。

1.3 細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng) 人胚腎細(xì)胞HEK293和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO-K1分別用含10%的胎牛血清(Fatal bovine serum，F(xiàn)BS)的H-DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 常規(guī)分子生物學(xué)方法 感受態(tài)細(xì)胞制備、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳等常規(guī)分子生物學(xué)方法參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第2版(科學(xué)出版社，1998)。質(zhì)粒的抽提制備方法參考QIAGEN公司生產(chǎn)的試劑盒操作流程。

1.5 穩(wěn)定表達(dá)人源5-HT1A受體細(xì)胞模型建立方法 實(shí)驗(yàn)采用熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)方法，將HEK293細(xì)胞以2.5×108cells·L－1(每皿4 ml培養(yǎng)基)的密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)到50% ～70%時(shí)，pcDNA3.1-h5-HT1A質(zhì)粒與 pcDNA3.1-pCRE-luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞以不同比例稀釋到10 cm培養(yǎng)皿中，24 h后加入G418進(jìn)行篩選，每3天換液，培養(yǎng)基含有G418抗生素，2周后用濾紙片法挑選單克隆，用陽(yáng)性化合物進(jìn)行活性驗(yàn)證，根據(jù)信號(hào)值和信噪比的大小，選擇陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，連續(xù)傳代，并檢測(cè)活性，觀察各代信號(hào)值和信噪比，挑選穩(wěn)定的克隆培養(yǎng)，用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.6 活性檢測(cè)方法 細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，加入5 μmol·L－1Forskolin孵育30 min，然后加入不同濃度的陽(yáng)性化合物，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育6 h后，用Steady-glo試劑盒在Flex Station 3酶標(biāo)儀上檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5軟件處理，劑量依賴曲線通過(guò)非線性回歸分析中Dose-response-Inhibition的公式擬合而成，進(jìn)而計(jì)算IC50。

2 結(jié)果

5-HT1A受體在細(xì)胞中主要有cAMP信號(hào)通路和磷脂酰肌醇信號(hào)通路，前者受體下游偶聯(lián)Gi蛋白，影響cAMP水平;后者受體偶聯(lián)Gq蛋白，引起胞內(nèi)外鈣流變化，可采用檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子濃度的方法［6］。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)發(fā)光的方法檢測(cè)胞內(nèi)cAMP，從而檢測(cè)受體的活性狀態(tài)。

2.1 工具細(xì)胞的選擇 建立穩(wěn)定表達(dá)5-HT1A受體的細(xì)胞株首先應(yīng)選擇合適的工具細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)室常用的工具細(xì)胞有CHO-K1和HEK293。本實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)到的化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度和靈敏度為指標(biāo)對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行比較和選擇。將細(xì)胞接種于96孔板中，并對(duì)接種密度進(jìn)行了摸索，CHO-K1細(xì)胞接種密度為20 000個(gè)/孔，HEK 293細(xì)胞接種密度為25 000個(gè)/孔(每孔100 μl)。Fig 1顯示，A組為質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)CHO-K1細(xì)胞，B組為質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)HEK 293細(xì)胞;與A組相比，B組加陽(yáng)性激動(dòng)劑APD356刺激后信噪比較高，因此，在本實(shí)驗(yàn)中選擇HEK 293細(xì)胞作為工具細(xì)胞來(lái)建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

Fig 1 Effect of APD356 acting on two different cells

2.2 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)比例摸索與克隆挑選 為了獲得更高的信噪比和靈敏度，實(shí)驗(yàn)對(duì)h5-HT1A受體質(zhì)粒和報(bào)告基因pCRE-luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)比例進(jìn)行了探索。實(shí)驗(yàn)設(shè)5組轉(zhuǎn)染比例，pcDNA3.1-h5-HT1AR:pcDNA3.1-pCRE-luc分別為 1 ∶1，1 ∶2，1 ∶3，1 ∶4，1 ∶5，結(jié)果表明，在陽(yáng)性激動(dòng)劑 APD356的刺激下，各組轉(zhuǎn)染比例結(jié)果相近，但相對(duì)而言，當(dāng)pcDNA3.1-h5-HT1AR:pcDNA3.1-pCRE-luc比例為1∶3時(shí)化合物作用后信噪比最好，為3倍左右，而其他比例為2倍左右(Fig 2)。因此在后面的研究中選擇兩者的轉(zhuǎn)染比例為1∶3。按上述轉(zhuǎn)染比例進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)，挑選到了4個(gè)較好的克隆(Fig 3)，其中8號(hào)和24號(hào)信噪比較高，有4～5倍，從而進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，而8號(hào)克隆在連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中信號(hào)逐漸降低，24號(hào)克隆信號(hào)穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)選擇24號(hào)克隆進(jìn)行下一步的研究。

Fig 2 Effect of different plasmid ratios(±s，n=3)

Fig 3Activity of four stable line cells(±s，n=3)

2.3 化合物孵育時(shí)間的摸索 由于胞內(nèi)cAMP的水平調(diào)控下游報(bào)告基因pCRE-luc的表達(dá)，而后者的蛋白質(zhì)表達(dá)水平因時(shí)間而變化，因此，為了得到最優(yōu)檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)選取了1～7 h的化合物孵育時(shí)間進(jìn)行信號(hào)強(qiáng)度檢測(cè)和比較。具體的細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及檢測(cè)過(guò)程見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法，陽(yáng)性化合物為25 μmol·L－1的APD356。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物孵育時(shí)間在1～5 h隨時(shí)間越長(zhǎng)作用效果越明顯，而信號(hào)值在5～7 h內(nèi)穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)選擇最佳孵育時(shí)間為6 h(Fig 4)。

2.4 不同激動(dòng)劑對(duì)信號(hào)的影響 cAMP信號(hào)通路中，5-HT1A受體下游偶聯(lián)Gi蛋白，在激動(dòng)劑作用下，胞內(nèi)cAMP水平降低。而在本實(shí)驗(yàn)的體系中，胞內(nèi)cAMP水平通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)水平得以體現(xiàn)，即當(dāng)激動(dòng)劑作用于受體時(shí)，報(bào)告基因luciferase的表達(dá)下降。實(shí)驗(yàn)選取了4種經(jīng)典的5-HT1A受體激動(dòng)劑進(jìn)行研究。

Fig 4 Effect of APD356 with different incubation time

2.4.1 5-HT.HCl5-羥色胺俗稱血清素，既是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，又是一種血管活性物質(zhì)，它為5-HT受體的內(nèi)源性配體。5-HT1A受體偶聯(lián)Gi蛋白，理論上與其激動(dòng)劑結(jié)合后使cAMP水平降低，但選擇5-HT.HCl為陽(yáng)性藥時(shí)空白組(加Forskolin)數(shù)值較加藥組低，即加藥組cAMP水平卻升高，F(xiàn)ig 5顯示 EC50為(532.5 ±1.8)nmol·L－1，與理論推測(cè)結(jié)果相反，這一結(jié)果可能是由于工具細(xì)胞HEK 293上存在內(nèi)源型5-HT受體的其它亞型，這些亞型在5-HT.HCl的刺激下可以升高胞內(nèi)cAMP水平，而這些亞型對(duì)cAMP水平的影響大于5-HT1A受體，因此，最終綜合的胞內(nèi)cAMP水平表現(xiàn)為升高。

Fig 5 Activity of agonist 5-HT.HCl(±s，n=3)

2.4.2 Flibanserin Flibanserin 為 5-HT1A受體的選擇性激動(dòng)劑，同時(shí)是5-HT2A受體的拮抗劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明空白組(加Forskolin)數(shù)值較加藥組高，而加入不同濃度的化合物于細(xì)胞中卻發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有不同程度的損傷(Fig 6)，因此Flibanserin可能對(duì)HEK 293細(xì)胞具有毒性。為了驗(yàn)證這一作用，用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)，檢測(cè)了Flibanserin對(duì)HEK 293細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示Flibanserin濃度大于10 μmol·L－1時(shí)抑制了HEK 293細(xì)胞的生長(zhǎng)(Fig 7)，而其它幾個(gè)陽(yáng)性化合物并沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒性。因此這個(gè)陽(yáng)性化合物不適合用于以HEK 293細(xì)胞作為工具細(xì)胞的5-HT1A受體穩(wěn)定細(xì)胞株。

Fig 6Activity of agonist Flibanserin(±s，n=3)

Fig 7Absorbance value of different agonists(±s，n=3)

2.4.3 Lorcaserin(APD356)據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Lorcaserin(APD356)是5-HT2C受體的激動(dòng)劑［7］，同時(shí) APD356也是5-HT1A受體、5-HT6受體和5-HT7受體的激動(dòng)劑，它對(duì)3者的活性值 Ki值分別為:0.7、2 和 0.64 μmol·L－1［8］。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，HEK293細(xì)胞上并不存在內(nèi)源型表達(dá)的5-HT2C受體和5-HT1A受體，而內(nèi)源型表達(dá)的5-HT6受體和5-HT7受體偶聯(lián)Gs蛋白，能使cAMP水平升高［9］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明陽(yáng)性化合物APD356作用于HEK-293-h5-HT1A受體細(xì)胞，在Forskolin存在下，劑量依賴性的降低 cAMP信號(hào)，IC50為(6.6±1.5)μmol·L－1(Fig 8)。因此，APD356 主要在 5-HT1A受體上發(fā)揮了作用，同時(shí)也說(shuō)明了外源轉(zhuǎn)入的5-HT1A受體水平遠(yuǎn)高于5-HT6受體和5-HT7受體。因此，在該體系中APD356可作為陽(yáng)性化合物。

2.4.4 8-OH-DPAT 8-OH-DPAT 為 5-HT1A受體的激動(dòng)劑，文獻(xiàn)報(bào)道，在Forskolin或其他物質(zhì)刺激下，5-HT1A受體激動(dòng)劑在不同細(xì)胞中，cAMP變化水平不同［10－11］。本實(shí)驗(yàn)以HEK 293細(xì)胞作為工具細(xì)胞建立的細(xì)胞株上發(fā)現(xiàn)在Forskolin刺激的情況下，8-OH-DPAT并沒(méi)有明顯的激動(dòng)作用(Fig 9);而在無(wú)Forskolin刺激的情況下，8-OH-DPAT能劑量依賴性地增加本底cAMP的水平(Fig 10)，與5-HT1A受體偶聯(lián)Gi蛋白，受激動(dòng)后會(huì)降低胞內(nèi)cAMP水平這一機(jī)制現(xiàn)象相反。同時(shí)，以CHO-K1為工具細(xì)胞重復(fù)了這一實(shí)驗(yàn)，卻發(fā)現(xiàn)并無(wú)此現(xiàn)象，因此推測(cè)這一現(xiàn)象與細(xì)胞本身有關(guān)。研究者發(fā)現(xiàn)8-OH-DPAT同時(shí)也是5-HT7受體的中等強(qiáng)度的激動(dòng)劑，而HEK 293細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的5-HT7受體偶聯(lián)Gs蛋白，與配體結(jié)合后，增加本底cAMP水平，與對(duì)5-HT1A受體的作用相反。然而在上面實(shí)驗(yàn)中我們推斷外源轉(zhuǎn)入的5-HT1A受體表達(dá)水平遠(yuǎn)高于5-HT7受體，因此，8-OH-DPAT在 HEK 293-h5-HT1A受體細(xì)胞中的作用可能還存在其他機(jī)制。

Fig 8Activity of agonist APD356(±s，n=3)

Fig 9Activity of agonist 8-OH-DPAT(±s，n=3)

總結(jié)以上結(jié)果，在建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株時(shí)為了排除工具細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的蛋白帶來(lái)的干擾，需要選擇合適的陽(yáng)性化合物進(jìn)行驗(yàn)證。在本實(shí)驗(yàn)中建立的HEK293-h5-HT1A受體細(xì)胞株可選用APD356可作為陽(yáng)性化合物。

2.5 穩(wěn)定細(xì)胞株的建立和化合物篩選 綜合以上優(yōu)化條件，建立了穩(wěn)定表達(dá)5-HT1A受體細(xì)胞株(HEK293-h5-HT1AR)，該細(xì)胞株連續(xù)傳代12代，信號(hào)值和信噪比較穩(wěn)定。Fig 11顯示了激動(dòng)劑APD356對(duì)5-HT1A受體的激動(dòng)作用。利用該穩(wěn)定細(xì)胞模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的60多個(gè)化合物進(jìn)行了篩選，并對(duì)活性化合物在只轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-pCRE-luc質(zhì)粒的HEK293空細(xì)胞上進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示化合物96H在HEK293-h5-HT1AR細(xì)胞株上顯示對(duì)5-HT1A受體有激動(dòng)效應(yīng)，IC50為(4.3 ±1.5)μmol·L－1，而在無(wú)受體轉(zhuǎn)染的空細(xì)胞上沒(méi)有明顯作用(Fig 12)，初步判定該化合物可能是5-HT1A受體激動(dòng)劑。

Fig 10 Activity of agonist 8-OH-DPAT without Forskolin(±s，n=3)

Fig 11 Activity of APD356 in different generations of stable line cells(±s，n=3)

Fig 12 Activity of compound 96H

3 討論

抑郁癥已成為是一種因腦生化改變所致的疾病，臨床表現(xiàn)為情緒低落、悲觀、睡眠障礙，嚴(yán)重者有自傷和自殺沖動(dòng)。中樞去甲腎上腺素、5-羥色胺、多巴胺等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量過(guò)低及其受體功能低下等都被認(rèn)為是引起抑郁癥的原因［12］?？挂钟羲幨悄壳爸委熞钟舭Y最常規(guī)的處方藥。用于抑郁癥治療的藥物主要有3類:(1)三環(huán)類抗抑郁藥(TCA);(2)單胺氧化酶抑制劑(MAOI);(3)選擇性5-HT再攝取抑制劑(SSRI)［12］。但是這3類藥物都有各自的不足之處，因此開(kāi)發(fā)研究新型抗抑郁藥迫在眉睫。

動(dòng)物水平研究發(fā)現(xiàn)，5-HT1A受體調(diào)節(jié)抑郁和焦慮行為，其受體敲除(KO)的小鼠模型在整個(gè)生命周期中都表現(xiàn)出焦慮和抑郁現(xiàn)象［13］。5-HT1A受體是一個(gè)重要的靶標(biāo)，它在精神疾病如抑郁癥焦慮癥的治療過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。5-HT1A受體與激動(dòng)劑結(jié)合后，可以降低精神紊亂現(xiàn)象，因此，5-HT1A受體激動(dòng)劑的研究具有重大開(kāi)發(fā)價(jià)值。

在新藥研發(fā)過(guò)程中，構(gòu)建高通量篩選模型對(duì)新藥的發(fā)現(xiàn)起著至關(guān)重要的作用，它直接影響著藥物研發(fā)的速率［14］。對(duì)于5-HT1A受體，由于其在胞內(nèi)可以調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路，針對(duì)5-HT1A受體建立穩(wěn)定細(xì)胞株的方法中目前主要有胞內(nèi)鈣信號(hào)和cAMP的測(cè)定。在cAMP信號(hào)通路中，5-HT1A受體下游偶聯(lián)Gi蛋白，激動(dòng)劑與受體結(jié)合后能降低胞內(nèi)cAMP水平，從而降低報(bào)告基因pCRE-luc的表達(dá)。基于這一原理，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)化學(xué)發(fā)光的方法建立了穩(wěn)定表達(dá)5-HT1A受體的細(xì)胞株，同時(shí)對(duì)篩選體系進(jìn)行了優(yōu)化。首先，根據(jù)檢測(cè)得到的信號(hào)值和靈敏度確定了工具細(xì)胞類型和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例;其次，由于在cAMP的刺激下報(bào)告基因pCRE-luc的表達(dá)量受時(shí)間的影響，實(shí)驗(yàn)比較了化合物不同的孵育時(shí)間對(duì)信號(hào)的影響，選擇了最優(yōu)化合物孵育時(shí)間為6 h;最后，在此次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性化合物的選擇至關(guān)重要，一方面要考慮該陽(yáng)性化合物對(duì)于細(xì)胞的毒性，例如本實(shí)驗(yàn)中選擇性激動(dòng)劑Flibanserin，它對(duì)HEK-293具有細(xì)胞毒性，不適合作為陽(yáng)性對(duì)照;另一方面還要考慮該化合物是否是該細(xì)胞其它內(nèi)源型受體的配體以及其他因素的干擾，例如5-HT1A受體的激動(dòng)劑8-OH-DPAT，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有出現(xiàn)預(yù)想的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，其原因可能是受內(nèi)源表達(dá)5-HT7受體和其他因素的影響，顯然該化合物不適用于在該體系中作為陽(yáng)性化合物。總結(jié)以上各種因素，實(shí)驗(yàn)確定了最佳條件:選擇HEK-293為工具細(xì)胞，5-HT1A受體和pCRE-luc質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染比例為1∶3，而化合物的孵育時(shí)間選擇6 h，陽(yáng)性化合物選擇APD356。

本研究表明在建立穩(wěn)定株的過(guò)程中工具細(xì)胞的選擇和陽(yáng)性對(duì)照的選擇相當(dāng)重要，通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，我們成功地建立了一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)5-HT1A受體的細(xì)胞株并且確定了篩選平臺(tái)的最佳條件。該穩(wěn)定細(xì)胞株經(jīng)多次傳代驗(yàn)證該模型信號(hào)穩(wěn)定，可用于高通量篩選。同時(shí)，基于這一模型，我們篩選了60多個(gè)化合物發(fā)現(xiàn)了一個(gè)5-HT1A受體激動(dòng)劑，因此本研究對(duì)5-HT1A受體激動(dòng)劑的發(fā)現(xiàn)和研究具有重要的參考意義。

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