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    絲裂霉素C-聚乳酸凝膠兔氣管外壁給藥后體內(nèi)釋放量的測定

    2012-12-06 08:04:02彭莉莉李進讓張雙慶李佐剛
    中國藥理學(xué)通報 2012年5期
    關(guān)鍵詞:絲裂霉素外壁聚乳酸

    湯 瑤,孫 旭,李 響,彭莉莉,李進讓,張雙慶,聞 鎳,于 敏,李佐剛,李 波

    (1.中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監(jiān)測中心,北京 100176;

    2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春 130012;3.中國人民解放軍海軍總醫(yī)院,北京 100048)

    聚乳酸(PLA)是近年來臨床實驗中最常用的合成高分子聚合物[1-2],已通過FDA批準(zhǔn)。對于可降解植入劑的載體材料,PLA具備良好的生物相容性,對機體無毒性和無刺激性,對組織、血液、免疫等系統(tǒng)不產(chǎn)生副作用,聚乳酸在體內(nèi)經(jīng)非酶性酯鍵隨機水解生成低聚物,最終轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2和H2O排出體外,為體內(nèi)正常的代謝產(chǎn)物。PLA的不對稱碳鏈為非規(guī)整結(jié)構(gòu),有利于藥物均勻分布于基質(zhì)中,適用于藥物釋放系統(tǒng)[3-4]。

    絲裂霉素 C(mitomycin C,MMC)是一種非特異性抗腫瘤抗生素,對多種實體瘤有效。MMC主要經(jīng)靜脈途徑給藥,全身化療,對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞無特異性識別,具有骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)及肝腎功能障礙等毒副作用[5-7]。我們將MMC與PLA制成載藥溫敏型凝膠,藥物以受控的方式從載體中釋放,然后在局部組織上發(fā)揮藥效作用,具有良好靶向性、保持藥物活性、提高透膜能力、提高生物利用度,降低其毒副作用,提高療效。

    國外已有關(guān)于絲裂霉素C在動物和人體內(nèi)的測定方法及藥代動力學(xué)的研究報道[8-13],國內(nèi)對MMC在生物基質(zhì)中的液質(zhì)聯(lián)用方法報道較少。隨著液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在體內(nèi)藥物分析領(lǐng)域中的大量應(yīng)用[14-15],本研究采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)[16],建立簡便快捷、靈敏專屬的體內(nèi)藥物分析方法,研究絲裂霉素C-聚乳酸凝膠兔氣管外壁給藥后體內(nèi)藥物釋放量,為絲裂霉素C的臨床前藥代動力學(xué)研究提供方法學(xué)支持。

    1 材料與方法

    1.1 儀器 Thermo Accela-TSQ Quantum Access超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司),配有電噴霧離子源(ESI)和Xcalibur 2.0.7色譜工作站;LABCONCO CentriVap臺式冷凍離心濃縮儀(美國 LABCONCO公司);NEVAP112氮吹儀和OA-SYS加熱系統(tǒng)(美國Organomation Associoates公司);Mettler-Toledo AX205電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司);Advantec PWU-400型超純水儀(日本Advantec公司);Eppendorf Centrifuge 5415R高速臺式離心機(德國Eppendorf公司);Votex Genie-2渦旋儀(美國Scientific Industries公司)。

    1.2 藥品與試劑 絲裂霉素 C(Roche107409,純度98%,購自羅氏公司),曲安奈德(批號:100055-200302,純度>98%,中國食品藥品檢定研究院)。甲醇(色譜純,F(xiàn)isher Scientific公司),甲酸(色譜純,批號CDK4581,Wako公司),水為自制超純水,其余試劑均為分析純。兔空白血漿為海軍總醫(yī)院采血制備,-70℃凍存,使用前復(fù)融,離心,取上清液使用。

    1.3 藥物體內(nèi)緩釋實驗方法 成年健康新西蘭大白兔30只,體質(zhì)量為2~2.5 kg(海軍總醫(yī)院動物室),外科手術(shù),分離氣管前組織,對氣管外壁(約第2~5氣管環(huán))不斷搔刮至明顯充血,形成瘢痕組織。分別將0.2 ml載有不同的藥物劑量(0.05、0.1、0.2、0.4和0.6 mg)的聚乳酸凝膠與明膠海綿的混勻后置于損傷后的氣管外壁,并用半圓形的硅膠管固定,逐層縫合手術(shù)切口,于給藥前和給藥后的1、3、7、10、14 和 21 d,由耳緣靜脈采血 1 ml。將取得的全血置肝素抗凝處理過的離心管中,3 000 r·min-1離心 15 min,取上層血漿,置-70℃保存,待測。

    1.4 血漿樣品前處理方法 血漿室溫解凍后,精密吸取200 μl兔血漿于4.0 ml eppendorf管中,加內(nèi)標(biāo)溶液10 μl(10 mg·L-1曲安奈德甲醇溶液),振蕩混勻,再分別加入乙酸乙酯2.2 ml,振蕩2 min,以6 000 r·min-14℃離心 5 min,取上清液 2.0 ml于40℃離心濃縮揮干后,加200 μl流動相復(fù)溶,振蕩1 min,于7 000 r·min-14℃高速離心5 min,取上清液10 μl進樣分析。

    1.5 超高效液相色譜條件 色譜柱:Thermo Hypersil Gold C18(50 mm×2.1 mm,1.9 μm),預(yù)柱:Phenomenex Security Guard C18(4 mm×3.0 mm);流動相:甲醇:0.1%甲酸水溶液=90∶10,流速:0.2 ml·min-1,等度洗脫,柱溫:35。進樣量為 10 μl,整個分析時間為3 min。

    1.6 質(zhì)譜檢測條件 離子化方式為電噴霧(ESI);選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM);檢測離子為正離子。鞘氣壓力(N2)為20 arb(3 500 kPa),輔助氣壓力(N2)為5 arb(1.5 L·min-1),碰撞氣壓力(Ar)1.5 mTorr(0.2 Pa),噴霧電壓4 500 V,離子傳輸管溫度為300℃,掃描時間為 0.2 s,掃描寬度為 0.2 amu。MMC的碰撞能量(CE)為15 eV,采集離子為m/z 335.2→242.2。內(nèi)標(biāo)物曲安奈德的采集離子為m/z 435.2→415.2(8 eV)/397.3(11 eV)。

    1.7 標(biāo)準(zhǔn)樣品和最低定量限(LLOQ) 于10支具塞離心管中加入兔空白血漿200 μl,精密加入MMC標(biāo)準(zhǔn)溶液,使血漿中 MMC濃度分別為 1,2,5,20,50,100,200,500,800,1 000 μg·L-1,按“血漿樣品前處理方法”項下測定,記錄樣品及內(nèi)標(biāo)峰面積,用樣品濃度對樣品峰和內(nèi)標(biāo)峰面積之比作線性回歸。配制6份MMC的血漿樣品濃度為1 μg·L-1,并根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線求得每一樣本的測定濃度。

    1.8 準(zhǔn)確度與精密度 考察日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度與精密度(5 d)。按標(biāo)準(zhǔn)曲線配制方法制備含MMC(5,100,800 μg·L-1)低、中、高3 種濃度的含藥血漿樣品,測定后記錄峰面積比值。根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線求得準(zhǔn)確度與精密度。

    1.9 提取回收率及基質(zhì)效應(yīng) 配制含MMC濃度為5,100,800 μg·L-1的血漿樣品各 6 份,按“血漿樣品前處理方法”項下操作,與相應(yīng)濃度的純品溶液,加入內(nèi)標(biāo)對比。測定后以提取后的色譜峰面積與相同濃度樣品未經(jīng)提取獲得的色譜峰面積之比,計算提取回收率。

    取空白血漿,除不加內(nèi)標(biāo)外,其余按“血漿樣品前處理方法”項下操作得上清液,添加適當(dāng)濃度的MMC標(biāo)準(zhǔn)溶液,測得的峰面積和以流動相添加MMC標(biāo)準(zhǔn)溶液測得的峰面積之比,在5,100,800 μg·L-1的3個濃度平行6份樣品評價MMC在血漿中的基質(zhì)效應(yīng)。

    1.10 穩(wěn)定性考察 考察5和800 μg·L-1MMC血漿樣品在室溫放置0、2、4 h,-20℃冰箱內(nèi)冷凍保存0、6、28 d及3次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性。

    2 結(jié)果

    2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 取1.0 mg·L-1的MMC和內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在ESI源正離子檢測方式下進行一級質(zhì)譜分析(Q1掃描)和二級質(zhì)譜分析(子離子掃描,Q2掃描),得到各自的碎片離子,進而優(yōu)化噴霧電壓和碰撞能量,以準(zhǔn)分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強度得到最大時為最佳。將UHPLC與串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀連接,選擇各自的監(jiān)測離子對,再對離子傳輸管溫度、透鏡電壓、鞘氣壓、輔助氣壓等進行優(yōu)化,使進樣溶液中樣品的離子化效率得到最佳,得到本實驗的質(zhì)譜條件(見Tab 1):鞘氣壓20 arb(3 500 kPa),輔助氣 5 arb(1.5 L·min-1)。

    Tab 1中,MMC全掃描一級質(zhì)譜得到準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為基峰,對此峰進行產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜分析,主要生成碎片離子為m/z 242.2,該碎片離子峰為[M+H]+脫去HOCONH2得到m/z 274.1碎片離子峰[M+H-HOCONH2]+,繼續(xù)脫去CH3OH得到的[M+H-HOCONH2-CH3OH]+峰,m/z 242.2碎片離子穩(wěn)定且強度大,為基峰。內(nèi)標(biāo)曲安奈德全掃描一級質(zhì)譜主要生成[M+H]+峰,對此峰進行產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜分析,曲安奈德碎片離子較多,選擇響應(yīng)較強且穩(wěn)定的碎片離子,主要為:脫去HF生成m/z 415.2離子;進一步脫水生成m/z 397.3的離子。

    Tab 1 UHPLC-MS/MS parameters for mitomycin C and IS

    2.2 色譜分離和專屬性 在本色譜質(zhì)譜條件下,測定乙酸乙酯萃取處理過的空白血漿樣品、添加0.5 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液的血漿樣品、含有0.05 mg·L-1分析物和0.5 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液的血漿樣品和兔氣管外壁給藥后采集血漿樣品,比較上述4種血漿樣品選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)下獲得的色譜圖(見Fig 1)。采用優(yōu)化后的色譜條件以及SRM方式,其專屬性強,靈敏度高,血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物與內(nèi)標(biāo)物的測定,且內(nèi)標(biāo)物獨立出峰不干擾分析物的分離。

    2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低定量限(LOQ) 按“1.5”項下方法測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.007854X+0.0008116,r=0.997 7(權(quán)重系數(shù) W:1/x2)。MMC血藥濃度在1~1 000 μg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)對于0.997。對于靈敏度的測定,標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度被認(rèn)為最低定量限(LLOQ),因此MMC 的 LLOQ 為 1 μg·L-1,其日內(nèi)與日間準(zhǔn)確度和精密度分別為94.88%(RSD=9.9%,n=6)和93.52%(RSD=6.9%,n=3),此濃度下MMC的偏差小于20%,標(biāo)準(zhǔn)曲線中其它各點的峰面積的偏差小于15%。以定量離子對3倍信噪比(S/N)的響應(yīng)值對應(yīng)的樣品濃度作為檢出限(LOD),因此MMC的 LOD 為 0.2 μg·L-1。

    2.4 準(zhǔn)確度與精密度 本方法的日內(nèi)與日間準(zhǔn)確度和精密度通過分析 5,100,800 μg·L-1這 3 個濃度水平的各6個血漿樣品5 d內(nèi)得到的,分別在95.71% ~105.44%(RSD≤6.9%,n=6)和93.71% ~106.0%(RSD≤5.8%,n=5)。結(jié)果表明,準(zhǔn)確度與精密度在可接受范圍內(nèi)(±15%),符合生物樣本測定指導(dǎo)原則的要求。

    2.5 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) MMC在低、中、高3個濃度的提取回收率分別為95.46%±3.68%、104.9% ±2.23%和92.54% ±2.64%,結(jié)果基本一致?;|(zhì)效應(yīng)分別為98.61% ±4.61%、94.95% ±2.89%和95.23% ±3.85%,沒有觀察到基質(zhì)對于離子化(離子抑制或離子增強現(xiàn)象)的影響,本試驗方法可以有效排除內(nèi)源性物質(zhì)對測定的干擾,提高靈敏度,能夠在較低的濃度水平上完成MMC的定性和定量分析。

    Fig 1 Typical UHPLC-MS/MS chromatograms of mitomycin C and triamcinolone acetonide in rabbit plasma

    2.6 穩(wěn)定性試驗 MMC血漿樣品(5和800 μg·L-1)在室溫放置4 h測定結(jié)果分別為95.08% ±6.47%和100.9% ±3.26%,含量沒有下降;將血漿樣品于-20℃冰箱中分別儲存28 d,測定結(jié)果分別為98.20% ±4.29%和105.2% ±3.91%,含量沒有

    出現(xiàn)變化;將血漿樣品經(jīng)歷3次凍融循環(huán)后,測定結(jié)果分別為95.94% ±3.48%和101.0% ±2.42%,含量沒有下降。結(jié)果表明,MMC在上述條件下穩(wěn)定性良好,保證了分析過程中實驗操作的可靠性。

    2.7 兔血漿樣品測試與方法應(yīng)用 將本方法應(yīng)用于兔氣管外壁給藥后血藥濃度的測定中,每組6只成年健康兔,外科手術(shù),將0.2 ml載有(0.05、0.1、0.2、0.4和0.6 mg)MMC的聚乳酸凝膠與明膠海綿的混合體置于氣管外壁。于給藥后不同時間采血,從耳緣靜脈取血1 ml,測定血漿樣品中的MMC濃度(結(jié)果見Tab 2)。

    Tab 2 Plasma concentrations after single dose(0.05,0.1,0.2,0.4 and 0.6 mg)of mitomycinC-polylactide gel of ectotheca to rabbits(±s,n=6)

    Tab 2 Plasma concentrations after single dose(0.05,0.1,0.2,0.4 and 0.6 mg)of mitomycinC-polylactide gel of ectotheca to rabbits(±s,n=6)

    Time point Plasma concentration/μg·L -1 0.05 mg 0.1 mg 0.2 mg 0.4 mg 0.6 mg 1 d - - - 0.11 ±0.04 0.80 ±1.4 3 d - - - 0.13 ±0.07 -7 d 0.20 ±0.24 0.56 ±0.68 0.24 ±0.15 0.41 ±0.48 0.22 ±0.04 10 d 0.42 ±0.52 0.25 ±0.19 0.18 ±0.11 0.10 ±0.08 -14 d 0.20 ±0.19 0.36 ±0.25 0.11 ±0.03 0.11 ±0.06 0.22 ±0.15 21 d - - - 0.10 ±0.05 -

    3 討論

    本文采用UHPLC-MS/MS方法,測定新西蘭大白兔氣管外壁給予絲裂霉素C聚乳酸凝膠后血漿內(nèi)絲裂霉素C的濃度,并對體內(nèi)可能釋放的原型藥物進行了初步確證與定量,方法專屬性強、靈敏度高、分析時間短等特點,尤其適用于大批量生物樣品測定。

    本實驗對樣品前處理方法、色譜條件及質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化。為了更有效地避免內(nèi)源性物質(zhì)的干擾,縮短樣品前處理時間,選擇乙酸乙酯為提取溶劑并去除血漿雜質(zhì),萃取效果好,易于分離,操作簡單且回收率高。流動相中加入少量甲酸可以提高離子化效率,改善色譜峰形,提高靈敏度,有效排除內(nèi)源性物質(zhì)引起的基質(zhì)效應(yīng)。內(nèi)標(biāo)物的選擇與絲裂霉素C性質(zhì)相似,不干擾待測物的測定,并且得到良好分離。

    質(zhì)譜條件選擇效應(yīng)較高的ESI源,采用正離子方式檢測,優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。由一級質(zhì)譜選擇其分子離子,二級質(zhì)譜選擇其主要子離子,根據(jù)兩者子離子的色譜峰面積比定量。這種定量分析方法具有很強的專屬性,且定量準(zhǔn)確。

    聚乳酸被用作緩、控釋系統(tǒng)的載體材料,用于半衰期短或口服生物利用度低的藥物,其優(yōu)點可在幾周甚至幾個月內(nèi)以一定速率釋放藥物。絲裂霉素C與聚乳酸制成凝膠制劑用于局部給藥,具有良好靶向性并保持藥物活性,而體內(nèi)緩釋且吸收量少,血液濃度低,對全身的影響不大,可預(yù)防喉氣管瘢痕組織形成并對瘢痕組織形成的抑制作用。

    本文研究了絲裂霉素C-聚乳酸凝膠兔氣管外壁給藥后體內(nèi)釋放量,在反復(fù)摸索與調(diào)整試驗中確定了UHPLC-MS/MS條件,通過方法學(xué)驗證和應(yīng)用,證明該方法具有靈敏度高、操作簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點,但測定的絲裂霉素C含量極低,無法進行藥代動力學(xué)計算??赡苁怯捎诮z裂霉素C的給藥部位為氣管外壁,原型藥物難以吸收入血,因此血漿藥物濃度極低,且低于本方法的最低定量限,其結(jié)果有待于進一步證實。同時,還需摸索絲裂霉素C-聚乳酸凝膠的其它給藥劑量或給藥方式,并建立更靈敏的分析方法,以探究此劑型在體內(nèi)的藥動學(xué)行為。

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