蛇鉤口線蟲長沙分離株ITS基因的克隆及序列分析

王 挺，李 芬，何 鑫，段柳春，林 源，盛曉楓，劉 偉，劉 毅

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙410128)

鉤口線蟲(Hookworm)屬于線蟲綱(Nematoda)圓線蟲目的鉤口線蟲屬(Ancylostoma)，嚴(yán)重感染時可以引起腸炎，是一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲。目前，在熱帶和亞熱帶國家鉤蟲感染人數(shù)超過7.4億[1]。傳統(tǒng)的寄生蟲種類鑒定主要以形態(tài)學(xué)特征為主要依據(jù)，這對成蟲的鑒定有一定準(zhǔn)確性，但對于相近種，特別是蟲卵和幼蟲，形態(tài)學(xué)特征存在很大局限性。針對這種情況，選擇以基因為分子標(biāo)記進行這些方面的研究，大大促進了寄生蟲分子分類學(xué)的發(fā)展[2-3]。核糖體DNA(rDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)為介于18S和28S之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括ITS-1和ITS-2兩段序列。ITS序列存在于高度重復(fù)的核糖體中，在生物進化過程中顯示種的特征。近年來的研究表明：rDNA的ITS序列為寄生蟲的鑒定提供了遺傳標(biāo)記[4-6]。本研究分析長沙蛇體內(nèi)采集的鉤口線蟲ITS的遺傳變異情況，為蛇鉤口線蟲進一步的分子遺傳學(xué)研究和診斷研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲體樣品 蛇鉤口線蟲成蟲樣品分別采自長沙馬王堆大王蛇(AD1)、長沙西長街大王蛇(AD2)和烏稍蛇(AD3)，分離后用70%酒精保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、PCR試劑、DL2000DNA Marker購自TaKaRa公司；蛋白酶K購自Merck公司；WizardRSV Genom ic DNA Purification System購自Promega公司。

1.3 樣品DNA的制備 取出單個蟲體，沖洗后加入 Nucleilysis solution 200μL，EDTA(pH8.0)50μL，再加Proteinase K 20μL，55℃消化2h。消化的蟲體懸液按WizardRSV Genom ic DNA Purification System使用說明進行蟲體DNA提取。

1.4 目的基因擴增及克隆 采用文獻[7]的引物NC5和NC2擴增ITS，其序列為5'-GTAGGTGAAC CTGCGGAAGGATCATT-3'和5'-TTAGTTTCTTTTCC TCCGCT-3'，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。擴增體系為25μL，擴增條件為：94℃5min；94℃ 30s、55℃30s、72℃1m in，38個循環(huán)；72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收PCR產(chǎn)物，將其克隆于pGEM-T中，由華大基因生物有限公司進行測序。

1.5 ITS序列測定及分析 采用DNAStar 5.0軟件，將ITS基因測序結(jié)果與GenBank中登錄的代表性的線蟲ITS序列十二指腸鉤口線蟲(A.duodenale，AB504715)、犬鉤蟲(A.caninum，AB501354)、錫蘭鉤蟲(A.ceylanicum，DQ780009)、巴西鉤蟲(A.braziliense， DQ438069)、 狹 頭 鉤 蟲 (U.stenocephala，AF194145)和羊鉤蟲(B.trigonocephalum，AY439022)進行相似性比對和線蟲種系發(fā)育分析，以闊節(jié)裂頭絳蟲(D.latum)作為外群。利用Clustal X2.0及Mega 4.1軟件對獲得的3株蛇鉤口線蟲和GenBank中的代表性線蟲ITS序列進行比對及計算遺傳距離。利用Mega 4.1程序中的臨接法(Neighbor-joining method，NJ)繪制種系發(fā)育樹。臨接法在軟件默認(rèn)設(shè)置下進行分析；最大簡約法采用Branch and bound模型分析，采用自展檢驗(bootstrap test)估算所構(gòu)建系統(tǒng)樹的可靠性。

2 結(jié)果與討論

2.1 ITS基因PCR擴增結(jié)果 以NC2和NC5為引物，從3個蟲體樣品DNA均擴增出約750bp的特異性片段，與預(yù)期ITS片段長度(734bp)相符(圖1)。

M：DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：AD1；2：AD2；3：AD3；4：陰性對照M:DL2000DNA Marker;1:AD1;2:AD2;3:AD3;4:Negative control

2.2 序列測定及分析 測序結(jié)果顯示，以NC2和NC5為引物均擴增出蛇鉤口線蟲ITS片段大小為734bp，剔除引物后，均得到688bp的序列，對3條蛇鉤口線蟲ITS序列進行了種內(nèi)比較，結(jié)果顯示，3個不同個體間的ITS序列的差異為0.4%～1.0%；其樣品差異主要是存在堿基置換(圖2)。各長沙分離株之間相應(yīng)序列的相似性為98.7%以上，長沙分離株與基因庫中其它線蟲ITS序列的同源性較低。堿基組成分析結(jié)果顯示，3個樣品的序列存在10個可以作為其遺傳標(biāo)記的基因位點(圖2中核苷酸序列表現(xiàn)為A33G、C48T、A57G、G117A、A126G、T132C、G156A、T171C、G252A以及T279C)。

2.3 ITS系統(tǒng)發(fā)生樹 采用NJ法建樹方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹顯示，長沙分離株AD1、AD2、AD3之間相應(yīng)序列的相似性均為98%以上，長沙分離株與基因庫中其它線蟲ITS序列的同源性均低于89%(圖3)。3個長沙分離株ITS序列種間的變異遠遠大于種內(nèi)的變異，表明ITS能夠成為種間的遺傳變異提供遺傳標(biāo)記。采用NJ法構(gòu)建的進化樹與其具有一致性，均顯示出長沙各個地區(qū)分離株位于同一分支，系統(tǒng)發(fā)生樹中的Bootstrap值較高，長沙市分離株所屬的分支與其它線蟲所屬分支相隔較遠，能夠很好地得以鑒別。

圖2 長沙市蛇鉤口線蟲rDNA ITS序列比較分析Fig.2Sequence comparison of hookworm ribosomal DNA ITS isolate from Changsha

在動物遺傳關(guān)系分析中，尤其是對較低的分類階元，如同屬的種間及種內(nèi)水平的譜系關(guān)系的確定，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)對核糖體基因組進行分析，也是目前廣為應(yīng)用的方法。核糖體DNA具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快、母性遺傳、無組織特異性等特點，使之成為研究寄生蟲分類鑒定和群體遺傳的理想分子標(biāo)記[8-10]。

圖3 基于ITS基因序列以臨接法所構(gòu)建的自展一致樹Fig.3The Bootstrap consensus phylogram of the stationary tree reconstructed by Neighbor-Joining(NJ)using ITS sequences

本研究結(jié)果表明，蛇鉤口線蟲長沙分離株ITS序列的種內(nèi)相對保守，種間差異相對較大，表明ITS序列能夠作為蛇鉤口線蟲的遺傳標(biāo)記用于蛇鉤口線蟲的鑒定。本實驗所測的蛇鉤口線蟲長沙分離株的ITS序列在國內(nèi)外屬首次報道，研究結(jié)果為進一步研究蛇鉤口線蟲的群體遺傳結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

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