柔嫩艾美耳球蟲Serpin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其瞬時(shí)表達(dá)

李文超，呂 強(qiáng)，顧有方，宮鵬濤，李建華，張西臣*

(1.安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽(yáng)233100；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130062)

絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白(Serine protease inhibitor，Serpin)廣泛存在于寄生蟲中，其在調(diào)節(jié)外源和內(nèi)源性蛋白酶過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用。在球蟲中，Serpin通過(guò)抑制宿主絲氨酸蛋白酶活性，使蟲體在侵入過(guò)程中免受宿主蛋白酶的降解，從而逃避宿主的防御體系，有利于蟲體在宿主細(xì)胞體內(nèi)存活，Serpin也可以通過(guò)控制內(nèi)源性蛋白酶的活性，參與自身發(fā)育過(guò)程，尤其是在球蟲侵入細(xì)胞過(guò)程中有著重要的作用[1-2]。研究表明，柔嫩艾美耳球蟲(Eimeria tenella)Serpin重組蛋白對(duì)球蟲感染具有部分免疫保護(hù)力[3]，因此E.tenella Serpin基因可以作為球蟲病疫苗研制的候選分子，用于球蟲病的防治研究。本研究以E.tenella Serpin基因?yàn)檠芯繉?duì)象，構(gòu)建含有Serpin基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，并在Hela細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，為深入研究Serpin基因的生物學(xué)功能及E.tenella核酸疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲株、菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞株 E.tenella長(zhǎng)春株、pVAX1真核表達(dá)載體和Hela細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coli TOP10購(gòu)自長(zhǎng)春寶泰克生物科技公司；pMD-Serpin載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.2 主要試劑 Bam HⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、DL2000購(gòu)自TaKaRa公司；凝膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Biolux公司；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Roche公司；抗E.tenella雞陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)在 1∶12800以上；HRP標(biāo)記的鼠抗雞IgG(HRP-IgG)和FITC標(biāo)記的鼠抗雞IgG(FITC-IgG)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 E.tenella Serpin基因的擴(kuò)增 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有E.tenella Serpin全長(zhǎng)基因的pMD-Serpin序列設(shè)計(jì)引物，去除Serpin基因信號(hào)肽序列后，引物序列引入Bam HⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線)，P1：5'-GCGGATCCATGGAGCGTTCAACAATCACC-3'， P2： 5'-GCCTCGAGCTTGCCTCCTGTTTGCTTG TAG-3'。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

參照Ex Taq DNA聚合酶反應(yīng)體系對(duì)Serpin基因進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃5min；95℃1m in，61℃ 45s、72℃ 45s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7m in。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收連接pMD18-T載體(命名為pMDSerpin)，轉(zhuǎn)化E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后的陽(yáng)性菌株由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.4 真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將pMD18-T-Serpin和pVAX1質(zhì)粒用Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收后連接，轉(zhuǎn)化E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，PCR和酶切鑒定。鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pVAX1-Serpin。

1.5 pVAX1-Serpin體外瞬時(shí)表達(dá)及間接免疫熒光(IFA)鑒定 按照轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明書的方法將pVAX1-Serpin轉(zhuǎn)染于生長(zhǎng)密度達(dá)到80%左右的Hela單層細(xì)胞。37℃5%CO2培養(yǎng)42h，固定細(xì)胞，以E.tenella陽(yáng)性血清為一抗，以鼠抗雞FITCIgG為二抗，進(jìn)行IFA檢測(cè)。同時(shí)設(shè)pVAX1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞及正常Hela細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.6 表達(dá)產(chǎn)物western blot分析 胰酶消化轉(zhuǎn)染48h的Hela細(xì)胞，同時(shí)取pVAX1轉(zhuǎn)染細(xì)胞與正常細(xì)胞作對(duì)照，將細(xì)胞裂解物進(jìn)行SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜后，以E.tenella陽(yáng)性血清為一抗，以鼠抗雞HRP-IgG為二抗進(jìn)行western blot鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 E.tene lla Serpin基因擴(kuò)增及真核表達(dá)重組質(zhì)粒鑒定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在1200bp左右出現(xiàn)明顯的片段(圖1)。pMD-Serpin經(jīng)測(cè)序表明，與GeneBank中登錄的E.tenella Serpin基因同源性達(dá)100%。pVAX1-Serpin經(jīng)PCR鑒定正確，經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切，產(chǎn)生3000bp和1024bp兩條片段，與預(yù)期相符。

圖1 E.tenella Serpin基因PCR擴(kuò)增Fig.1PCR amplification of E.tenella Serpin gene

2.2 IFA檢測(cè)E.tenella Serpin在Hela細(xì)胞中的表達(dá) IFA結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pVAX1-Serpin的細(xì)胞中可見(jiàn)明顯的綠色熒光(圖2)，而轉(zhuǎn)染pVAX1質(zhì)?；蛭崔D(zhuǎn)染的的細(xì)胞中未見(jiàn)熒光，結(jié)果表明pVAX1-Serpin基因在Hela細(xì)胞中得到了表達(dá)。

2.3 Western blot結(jié)果 Western blot顯示，轉(zhuǎn)染了pVAX1-Serpin的細(xì)胞可見(jiàn)一條約47ku的特異性表達(dá)條帶。而轉(zhuǎn)染了pVAX1的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常細(xì)胞中未見(jiàn)到明顯的條帶，顯示由pVAX1真核表達(dá)載體介導(dǎo)的Serpin蛋白在Hela細(xì)胞中得到了有效的表達(dá)，其能夠被鼠抗雞E.tenella免疫血清識(shí)別，表明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性(圖3)。

圖2 IFA檢測(cè)E.tenella Serpin蛋白在Hela細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2Identification of the E.tenella Serpin expressed in Hela cells by IFA

圖3 表達(dá)產(chǎn)物western blot分析Fig.3Western blot analysis of expression products

Serpins能夠與生物體內(nèi)參與調(diào)控作用的絲氨酸蛋白酶相互作用，形成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，從而起到調(diào)控作用，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)許多重要的生命活動(dòng)，是維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，其在宿主體內(nèi)的定居、蟲體的發(fā)育過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用，因而其被認(rèn)為是新藥開發(fā)的作用靶標(biāo)和新型疫苗的候選抗原。

球蟲中Serpins的研究較晚，目前已在弓形蟲[4]、犬新孢子蟲[5]、E.tenella[1]、堆型艾美耳球蟲[6]、巨型艾美耳球蟲[7]中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有Serpins基因的存在，但均主要集中在Serpins基因的一些基本特性研究方面。而有關(guān)Serpins基因作為球蟲保護(hù)性抗原的研究的內(nèi)容更少，并且主要在原核表達(dá)方面。姜連連等的研究表明原核表達(dá)的Serpin重組蛋白對(duì)雞只在增重、盲腸病變記分方面影響不大，但可以明顯降低免疫組的卵囊產(chǎn)量，而且一免后7d雞體內(nèi)即可以產(chǎn)生明顯的特異性免疫抗體，并且這種抗體水平可以持續(xù)到攻蟲后7d，表明該重組蛋白具有良好的免疫原性，可以產(chǎn)生對(duì)球蟲感染的部分免疫保護(hù)力[3]。

本研究首先應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得E.tenella Serpin去除信號(hào)肽后的序列，與GenBank中相應(yīng)基因序列的一致性達(dá)100%，隨后構(gòu)建了pVAX1-Serpin重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞并得到表達(dá)。Western blot分析表明該蛋白分子量為47ku，大于表達(dá)蛋白理論預(yù)測(cè)值(44ku)，可能是真核表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生了糖基化所致[8]，其能夠被鼠抗雞E.tenella免疫血清識(shí)別，表明該重組蛋白具有良好的免疫原性，本研究為下一步研究E.tenella Serpin核酸疫苗的免疫活性和動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)等奠定了基礎(chǔ)。

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[6]Fetterer R H,M iska K B,Jenkins M C,et al.Identification and characterization of a serpin from Eimeria acervulina[J].JParasitol,2008,94(6):1269-1274.

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