雞痘病毒分離株及疫苗株整合網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的基因分析

車國喜，孫洪磊，于 宏，李 超，劉立濤，劉思當*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安271018；2.中國農(nóng)業(yè)大學，北京100193；3.泰安市畜牧獸醫(yī)局，山東泰安271018；4.夏津縣畜牧獸醫(yī)局，山東夏津253200)

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)基因片段或全基因整合進雞痘病毒(Fow lpox virus，F(xiàn)PV)已成為關(guān)注的焦點。國外陸續(xù)報道了FPV整合有REV前病毒基因序列，即野毒株中含有REV病毒全基因序列，疫苗中整合有REV的長末端重復序列(Long terminal repeat，LTR)片段或全基因序列[1-6]。在我國，自2004年丁家波、崔治中等首次報道FPV基因組中整合有REV基因[7]以來，近幾年陸續(xù)有報道稱分離到的FPV野毒株中含有REV前病毒全基因序列，疫苗株整合有REV的LTR片段或者是全基因序列[8-9]。FPV基因組中有完整REV前病毒基因組整合對養(yǎng)雞業(yè)是一種的潛在危脅[5]。至今，F(xiàn)PV野毒株的REV整合區(qū)全基因分析以及有關(guān)FPV野毒株和疫苗株整合序列差異比較的報道尚屬少見。因此，本研究通過基因分析，了解山東地區(qū)FPV野毒流行株整合REV序列的情況，同時比較FPV分離株和弱毒疫苗株自然整合REV前病毒序列的差異，評估國內(nèi)當前使用疫苗的缺陷及潛在風險，進而為有效預防雞痘及禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病奠提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要試劑 14個FPV分離株為山東農(nóng)業(yè)大學動科院臨床病理學實驗室于2008年~2011年間自山東各地送檢的雞痘典型病例中分離鑒定及保存，代號依次為1～14；5株疫苗代號依次為：V1、V2、V3、V4和V5，其中V5為進口疫苗株。LA Taq DNA聚合酶、r Taq、DL15000DNA Marker、膠回收試劑盒等購自TaKaRa公司。

1.2 實驗動物及病毒擴增 9日齡～11日齡SPF雞胚購自山東省農(nóng)科院家禽所；痘病毒增殖按常規(guī)接種雞胚的方法進行。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)普遍整合位點，參考文獻[1]設(shè)計合成兩對擴增FPV整合區(qū)全長序列引物(表 1)。

1.4 PCR反應條件及產(chǎn)物純化 P1/P2引物：93℃1min、55℃ 2min、68℃ 6.5m in，30個循環(huán)。P3/P4引物：93℃1m in、55℃2m in、68℃6m in，30個循環(huán)。201F/203R引物：用r Taq酶擴增：94℃1m in、56℃ 1min，72℃ 6.5min，30個循環(huán)。用LA Taq酶擴增：94℃50s、56℃30s、72℃9m in，30個循環(huán)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用膠回收試劑盒回收、克隆于pMD18-T載體中由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。

表1 引物序列Table 1Sequence of primers

1.5 測序及基因分析 對5個FPV疫苗株和隨機挑選的4個分離株進行測序，測序結(jié)果采用DNA Star軟件進行序列拼接、比對、同源性分析并生成基因進化樹。

2 結(jié)果

2.1 FPV疫苗株及分離株的REV整合區(qū)PCR擴增結(jié)果 以疫苗直接提取的DNA為模板，采用特異性引物對201F/203R進行擴增。分離株以感染的雞胚雞胚絨毛尿囊膜(CAM)上的痘斑研磨液提取的DNA為模板，分別采用特異性引物對P1/P2和P3/P4進行擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明4株國產(chǎn)疫苗擴增片段大小相近(圖2A)，約1400bp，而進口疫苗V5片段較大，約1700bp；14個分離株擴增片段大小基本相同，P1/P2引物對和P3/P4引物對均得到了預期大小分別為6300bp(圖 2B)和 5900bp(圖 2C)的片段。

A:PCR amplification of FPV vaccine strainswith 201F/203R primers;1-5:PCR products of V1,V2,V3,V4and V5;6:Negative control;M:DNA Marker

B:PCR amplification of FPV isolateswith P1/P2primers;1-14:PCR products of FPV isolates 1-14;15:Negative control;M:DNA Marker

圖1 FPV疫苗株及分離株REV整合區(qū)PCR擴增結(jié)果Fig.1Amplification of REV integrated regions of FPV vaccine strains and isolates by PCR

2.2 基因分析

2.2.1FPV疫苗株的整合區(qū)基因分析測序結(jié)果表明4株國產(chǎn)疫苗擴增序列長度分別為1378bp、1381bp、1382bp和1381bp，將測序結(jié)果錄入到GenBank中進行Blast顯示，4個序列均由3部分組成，aa 1～aa 822均為FPV的ORF201基因編碼，長822bp；第二部分均為REV的5'LTR，位于823bp～1015bp，長193bp；第3部分為FPV的ORF203，長分別 363bp、366bp、367bp和 366bp；這 4個整合LTR序列同源性高達100%，與FPV株AF006064(澳大利亞疫苗株)、AF198100(強毒株)、AY255633(分離株)和HP-438(高代次分離株)的同源性高達99.9%～100%。表明REV-LTR在FPV基因組中的存在具有很悠久的淵源。

但整合的LTR序列與REV的美國標準株SNV和中國標準株HA9901同源性分別為70.4%和76.3%(表 2)，與國外(APC-566)、臺灣(Chicken 3337/05和Goose 3410/06)、中國大陸(HLJ071、ZD0708和HLJR0901)的REV分離株同源性均為99.0%。與國外分離的整合REV全序列的FPV野毒株(AF246698)的LTR序列同源性平均為100%(表2)，表明這些LTR整合序列與REV株的LTR序列同源性不盡相同，與REV標準株同源性較低，與近期分離的REV株LTR序列的同源性較高，而與已知的整合株LTR同源性則高達100%。基因遺傳進化樹分析也顯示了這種關(guān)系(圖2)。

表2 整合LTR序列的同源性圖譜Table 2Homologymap of integrated LTR

圖2 FPV疫苗株整合LTR基因進化樹Fig.2 Genetic evolution tree of integrated LTR for FPV vaccine strains

然而，進口疫苗V5的片段長度為1638bp，其中整合的LTR長度為486bp，該LTR序列與REV標準株和已知REV株的同源性與4株國產(chǎn)疫苗相似，但與國外分離株的整合全長LTR序列的FPV AY255633的LTR序列同源性高達100%，與4株國產(chǎn)疫苗相比，進口疫苗V5整合的LTR片段相對較完整。

2.2.2FPV分離株的整合區(qū)基因分析隨機選取的4個分離株5、10、12和14進行測序，拼接之后長度分別為10306bp、10306bp、10168bp和10304bp，這些序列均由3部分組成：第1部分為FPV ORF201的1bp～904bp，各株間相同；中間部分為整合的REV序列，5、10、12和14株該段長度分別為7938bp、7938bp、7799bp和 7936bp；第3部分為FPV的ORF203，長度1464bp。樣品間整合區(qū)REV序列同源性為99.6%～100%(表3)，除分離株12(YY2010)在REV的gag基因有兩段共138bp的缺失以外，其間差異甚微。

這些整合序列與美國分離的整合株整合區(qū)REV序列同源性最高，均在99.5%以上；與美國REV標準株SNV同源性平均為96.1%(95.9%～96.2%之間)，與國內(nèi)REV標準株HA9901同源性平均為97.7%(97.4%～97.8%之間)，而與國內(nèi)外分離的REV株的同源性差異不大，均在99%以上(表3)。以上結(jié)果表明山東地區(qū)的FPV分離株的整合區(qū)REV序列高度同源，與國外FPV整合株的整合區(qū)REV序列同源性最高，與國內(nèi)外REV分離株的同源性較高并且差異不大，而與標準株的同源性較低?；蜻z傳進化樹分析也顯示了這種關(guān)系(圖3)。

表3 FPV野毒株整合區(qū)基因的同源性圖譜Table 3Homology of integrated sequences from FPV field strains

圖3 FPV分離株整合區(qū)基因進化樹Fig.3Genetic evolution tree of integrated sequences from FPV isolates

整合區(qū)LTR序列比較結(jié)果顯示：4個分離株整合的LTR序列基本一致，5'LTR長度為517bp，3'LTR長度為222bp，與國內(nèi)外已知的REV株相比，這些整合株的3'LTR變異較大，其長度明顯縮短。

3 討 論

REV序列在FPV疫苗株和野毒株中的整合已是普遍現(xiàn)象，但對于整合序列的報道并不多見。本研究根據(jù)普遍存在的整合位點，分別從FPV和REV基因設(shè)計上下游引物，在得到整合區(qū)全序列的同時，還避免了因REV游離病毒粒子存在導致的非特異性擴增。

本研究結(jié)果顯示2008年～2011年間分離的山東地區(qū)14個FPV分離株整合REV前病毒的位置一致，均位于FPV-201ORF和203ORF之間，而且極其一致地整合了幾乎完整的REV前病毒基因序列。整合的REV序列與國外分離的整合株同源性最高，與REV株同源性較高，但與REV標準株同源性較低。其中整合區(qū)LTR序列變異最大，尤其是3'LTR明顯縮短，這表明整合的REV序列經(jīng)過了修飾，使之與FPV序列之間的結(jié)合更適于兩者的生存和復制，整合過程中的這種修飾與REV-LTR，尤其是3'LTR的明顯缺失有關(guān)。國外也有類似報道[3-4,9]。分離株5、10和14的整合區(qū)序列高度同源，無論是整合的LTR基因還是中間的gag、pol和env基因均差異甚微，這有可能如現(xiàn)在報道的兩株MDV所體現(xiàn)出來的現(xiàn)象[10]，即這3株FPV野毒株很有可能是來自同一個原始重組病毒，由該原始重組病毒在雞群中形成的流行病毒株。而分離株12由于gag基因出現(xiàn)較區(qū)域缺失可能與其他3株來自不同的原始重組病毒。

然而，國內(nèi)外不同廠家的5株疫苗，均僅僅整合了REV前病毒的5'LTR序列,這與國外報道的所有FPV疫苗中均存在REV-LTR序列一致[4]。這些LTR序列在長度上分為兩種，國產(chǎn)疫苗整合的LTR長度相對于進口疫苗較小。對于疫苗整合片段大小不同，在疫苗效力、安全性等方面的差異有待進一步研究。

整合幾乎全長REV前病毒序列的FPV已成為流行雞痘的優(yōu)勢病毒株，關(guān)于整合野毒株的致病特性，國外有報道稱整合的REV序列具有感染性，并且可以復制，同時引起感染雞出現(xiàn)持續(xù)3周以上的病毒血癥，并表現(xiàn)明顯的免疫抑制作用[1-2,6]。本實驗室前期的研究中顯示FPV整合野毒株除表現(xiàn)痘病病變外，還表現(xiàn)某些REV的致病特性，造成感染雞持續(xù)性的免疫抑制，使REV抗體轉(zhuǎn)陽，并出現(xiàn)REV病毒血癥[11-12]，進一步證實REV可以通過基因組整合于FPV而進行傳播的推斷。

但目前雞痘的高發(fā)病率和免疫失敗現(xiàn)象與REV前病毒序列整合相關(guān)的更多內(nèi)在聯(lián)系，整合部分或全部REV-LTR序列的FPV疫苗的安全性，以及這些疫苗對整合幾乎全長REV前病毒序列的FPV野毒的免疫保護作用，目前未見深入的研究報道，應進一步研究探討。

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