豬白細(xì)胞介素6基因的克隆及其作為核酸免疫佐劑的研究

楊 恒，李華春*，文心田，曹三杰

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明650224；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川雅安625014)

白細(xì)胞介素6(Interleukin-6，IL-6)由多種淋巴樣細(xì)胞和某些非淋巴樣細(xì)胞產(chǎn)生，分子量為19ku～28ku，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)急性期蛋白、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與維持和造血干細(xì)胞的增殖中均起著重要作用[1]。在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面，IL-6作為B淋巴細(xì)胞刺激因子，能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖分化，從而增加Ig類抗體(IgM、IgG、IgA)的分泌[2]；IL-6也能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的活化增殖，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2以及表達(dá)IL-2受體[3-4]。目前，IL-6已廣泛應(yīng)用于疫苗佐劑、腫瘤治療、疾病診斷等領(lǐng)域研究，具有良好的應(yīng)用前景。

Richards等首次從豬滑膜成纖維樣細(xì)胞中克隆了豬 IL-6(p IL-6)的 cDNA[5]，Nuntaprasert等在桿狀病毒、大腸桿菌與動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)了具有生物學(xué)活性的rp IL-6蛋白[6]。嚴(yán)琳等將原核表達(dá)的rpIL-6作為疫苗佐劑，有效提高了偽狂犬病基因缺失疫苗的免疫效力[7]；Wu等的研究表明p IL-6重組真核表達(dá)質(zhì)粒作為佐劑可以提高豬丹毒、豬肺疫、豬霍亂三價(jià)滅活苗的特異性抗體水平[8]，這提示p IL-6是一種較有潛力的的疫苗佐劑。目前對(duì)于將p IL-6作為DNA疫苗佐劑對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)尚未見系統(tǒng)報(bào)道，因此本研究克隆p IL-6并構(gòu)建其重組真核表達(dá)質(zhì)粒，分析p IL-6作為核酸免疫佐劑對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)核酸免疫的免疫增強(qiáng)效果，為將p IL-6作為DNA疫苗佐劑的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 pMD19-T載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；真核表達(dá)載體pVAX、TGEV S基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-S(含有S基因5'端約2.1kb的主要抗原位點(diǎn)編碼區(qū))[9]、大腸桿菌DH5α、COS-7細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。6周齡NIH小鼠(雌雄各半，清潔級(jí))購(gòu)自成都生物制品研究所。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、BcaBEST RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；蛋白質(zhì)Marker、動(dòng)物細(xì)胞RNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津TBD公司；兔抗rpIL-6蛋白多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存；羊抗鼠HRP-IgG、羊抗兔HRP-IgG酶標(biāo)抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；FITC標(biāo)記羊抗鼠CD4+、PE標(biāo)記羊抗鼠CD8+、SPRD標(biāo)記羊抗鼠 CD3+單克隆抗體(MAb)購(gòu)自美國(guó) Southern-Biotech公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank中登錄的pIL-6cDNA序列(NM_214399)設(shè)計(jì)引物L(fēng)1：5'-GCG GATCCGCTATGAACTCCCTCTCCACAA-3'(Bam HⅠ)和 L2：5'-GCGAATTCCTACATTATCCGAATGGCCC TC-3'(EcoRⅠ)用于擴(kuò)增p IL-6基因的完整編碼區(qū)，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 p IL-6基因的克隆 參照文獻(xiàn)[10]的方法從3月齡豬(DIY三元雜交)采血分離外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，加入適量的含10%小牛血清的 RPM I-1640培養(yǎng)基(含10μg/m L的ConA)，刺激培養(yǎng)12h～18h后離心收集細(xì)胞。按動(dòng)物細(xì)胞RNA提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA作為模板，以oligo dT為引物，按BcaBEST RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系如下：cDNA 5μL、L1和L2引物各1μL(25pmol/μL)、10×PCR Buffer 5μL、dNTP(2.5mmol/L)4μL、Taq DNA聚合酶(2.5U/μL)1μL，加入H2O補(bǔ)齊總體積至50μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃ 4min；94℃45s、53℃ 40s、72℃ 40s，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳膠回收后與pMD19-T載體連接。將獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR與酶切鑒定，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將獲得的重組質(zhì)粒命名為pMD-IL6。

1.5 p IL-6基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè) 將pMD-IL6以EcoRⅠ和Bam HⅠ進(jìn)行雙酶切，電泳膠回收純化目的DNA片段，將其連入真核表達(dá)載體pVAX中，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行PCR與酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pVAX-IL6。

使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取pVAX-IL6重組質(zhì)粒，按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明，轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)達(dá)80%的單層COS-7細(xì)胞。于轉(zhuǎn)染后的48h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。將PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，2%BSA封閉2h，以兔抗rp IL-6蛋白多克隆抗體(1∶500)作為一抗，以羊抗兔 HRP-IgG(1∶2000)為二抗，DAB顯色，進(jìn)行western blot鑒定。

1.6 小鼠分組與免疫 采用SDS堿裂解法制備質(zhì)粒DNA(大量制備)與聚乙二醇純化質(zhì)粒的方法，分別進(jìn)行pVAX-S、pVAX-IL6、pVAX質(zhì)粒的提取與純化。將NIH小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別設(shè)為pVAX-S+pVAX-IL6質(zhì)粒混合免疫組pVAX-S(100μg)+pVAX-IL6(100μg)/只、pVAX-S+pVAX質(zhì)粒混合對(duì)照組pVAX-S(100μg)+pVAX(100μg)/只、pVAX空載體質(zhì)粒對(duì)照組pVAX(100μg/只)、PBS陰性對(duì)照組(PBS 100μL/只)。腿部肌肉注射免疫小鼠，共免疫3次。分別于免疫前以及免疫后的14d、35d、42d，每組隨機(jī)取3只小鼠斷尾采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 免疫小鼠血清特異性TGEV IgG抗體的ELISA檢測(cè) 以蔗糖密度梯度離心純化TGEV作為包被抗原，4℃包被96孔板過(guò)夜。待檢血清1∶40倍稀釋，以1∶3000倍稀釋的羊抗鼠HRP-IgG作為二抗，通過(guò)TMB顯色，2mol/L硫酸終止反應(yīng)，讀取OD450nm值，所得數(shù)據(jù)用SPSS12.0軟件的One-Way ANVOA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 免疫小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量的檢測(cè)在小鼠免疫后的42d迫殺小鼠，眼球采血。取抗凝血0.1m L，加入4m L紅細(xì)胞裂解液，室溫作用10min，1500r/min離心10m in，棄上清，加入5m L PBS重懸，1500r/m in離心10m in，重復(fù)兩次。加入熒光標(biāo)記的的抗鼠CD4+、CD8+與CD3+MAb，4℃避光作用30min，熒光洗液洗兩遍，于流式細(xì)胞儀上測(cè)定外周血細(xì)胞中CD4+、CD8+、CD3+陽(yáng)性細(xì)胞百分率，所得數(shù)據(jù)用SPSS12.0軟件的One-Way ANVOA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 p IL-6基因的克隆、序列測(cè)定與分析 提取經(jīng)刺激培養(yǎng)PMBCs總RNA為模板，采用引物L(fēng)1和L2通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符，約600bp大小的片段(圖1)。將目的DNA片段連入pMD19-T載體，經(jīng)酶切鑒定顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。進(jìn)一步序列測(cè)定表明，擴(kuò)增的p IL-6基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為639bp，編碼212個(gè)氨基酸殘基。獲得的pIL-6編碼區(qū)核苷酸序列與GenBank中登錄的p IL-6參考序列(NM-214399)比較顯示，核酸序列在3處發(fā)生了變異，分別是103位(A→T)，291位(A→C)，589位(G→A)；導(dǎo)致對(duì)應(yīng)氨基酸序列34位(Asp→Val)，97位(Lys→Cys)，196位(Ser→Asn)氨基酸的改變。

圖1 pIL-6基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1Amplification of p IL-6gene by RT-PCR

2.2 p IL-6基因真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定與體外表達(dá)將pVAX-IL6質(zhì)粒以EcoRⅠ和Bam HⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，分別得到與預(yù)期pIL-6大小相符約600bp的DNA片段以及約3000bp的pVAX載體DNA片段，表明pVAX-IL6重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將pVAX-IL6轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞的培養(yǎng)液上清濃縮處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以兔抗rp IL-6蛋白多克隆抗體為一抗，western blot結(jié)果顯示：pVAX-IL6轉(zhuǎn)染后的COS-7細(xì)胞上清中出現(xiàn)大小約33ku的特異性蛋白條帶，而pVAX空載體未見特異性條帶。結(jié)果表明pVAX-IL6在細(xì)胞中獲得表達(dá)，并且表達(dá)的p IL-6蛋白分泌至胞外(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒pVAX-IL6在COS-7細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的western blot檢測(cè)Fig.2Western blot detection of pVAX-IL6expression product in COS-7cells

2.3 p IL-6真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)TGEV核酸免疫特異性免疫應(yīng)答的提高作用 將pVAX-IL6與pVAX-S混合后肌肉注射免疫小鼠，結(jié)果顯示：pVAX-S+pVAX-IL6免疫組TGEV抗體水平在免疫后的第14d略高于pVAX-S+pVAX對(duì)照組，但差異不顯著(p>0.05)；在 免疫后的第 35d、42d，pVAX-S+pVAX-IL6組抗體水平表現(xiàn)了較高的增長(zhǎng)水平，顯著高于(p<0.05)pVAX-S+pVAX組(圖3)。在免疫后的42d采集免疫組小鼠外周血，進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞類測(cè)定，結(jié)果表明：pVAX-S+pVAX-IL6免疫組CD3+T淋巴細(xì)胞亞類高于pVAX-S+pVAX對(duì)照組差異顯著(p<0.05)；在CD8+、CD4+T細(xì)胞亞類數(shù)量方面，pVAX-S+pVAX-IL6免疫組均高于pVAX-S+pVAX對(duì)照組，并且差異顯著(p<0.05)(圖4)。以上結(jié)果表明，pIL-6可以有效促進(jìn)TGEV核酸免疫的特異性體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖3 免疫小鼠血清中TGEV特異性IgG抗體的間接ELISA測(cè)定Fig.3Indirect ELISA analysis of anti-TGEV IgG antibody in serum ofm ice inoculated with different combinations of recombinant plasm ids

圖4 免疫小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞類數(shù)量測(cè)定Fig.4The proliferation of T-lymphocytes subgroups in peripheral blood ofmice after inoculated with different combinations of recombinant plasm ids

3 討論

細(xì)胞因子基因通常處于沉默狀態(tài)，其表達(dá)具有時(shí)空性，只有當(dāng)受到刺激原致敏后才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的mRNA在完成翻譯后很快降解，因此克隆存在一定難度。為有效擴(kuò)增pIL-6基因，本研究在加入ConA對(duì)PBMCs進(jìn)行刺激培養(yǎng)后的不同時(shí)間提取RNA，并采用兩步法進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果表明PBMCs刺激培養(yǎng)12h獲取的RNA為模板，擴(kuò)增出p IL-6基因。

本實(shí)驗(yàn)中選用western blot方法對(duì)pVAX-IL6在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。由于分泌到培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子蛋白濃度可能較低，培養(yǎng)上清液難于直接用于檢測(cè)，因此實(shí)驗(yàn)中通過(guò)凍干的方法對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液進(jìn)行了濃縮，提高培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子蛋白的濃度從而便于檢測(cè)。除去信號(hào)肽的pIL-6蛋白的預(yù)測(cè)分子量為21ku，而western blot結(jié)果顯示，pVAX-IL6在COS-7細(xì)胞中表達(dá)的pIL-6重組蛋白大小為25ku～30ku。通過(guò)對(duì)p IL-6蛋白糖基化的預(yù)測(cè)表明，其中存在N糖基化位點(diǎn)與O糖基化位點(diǎn)，因此推測(cè)可能是糖基化以及翻譯后的修飾導(dǎo)致了COS-7細(xì)胞中表達(dá)與pIL-6蛋白分子量大于推導(dǎo)值。

IL-6為Th2型細(xì)胞因子，該類細(xì)胞因子以增強(qiáng)體液免疫為主，降低免疫球蛋白亞類IgG2a/IgG1的比例，提升IgE的表達(dá)，弱化CD8+細(xì)胞免疫[11]?？紤]到體液免疫在抗TGEV感染中起著關(guān)鍵性作用，本研究中選取了可以提升體液免疫Th2型細(xì)胞因子IL-6作為TGEV DNA疫苗佐劑。pIL-6的生物學(xué)活性可用小鼠雜交瘤細(xì)胞B9或7DT1進(jìn)行測(cè)定，這提示IL-6在不同物種間的交叉活性很可能具有“向下兼容性”[12]，因此實(shí)驗(yàn)中我們選取了小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行p IL-6對(duì)DNA疫苗的佐劑效應(yīng)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞因子佐劑pIL-6對(duì)TGEV DNA疫苗免疫效力有較強(qiáng)的提升作用。pVAX-S+pVAX-IL6免疫組小鼠CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量、抗體水平顯著高于pVAX-S+pVAX對(duì)照組，一方面證明了IL-6在不同物種間的交叉活性的“向下兼容性”，另一方面也顯示了p IL-6作為豬DNA疫苗佐劑的良好應(yīng)用前景。前期研究中我們以減毒沙門氏菌傳遞TGEV S基因DNA疫苗取得了良好的免疫效果[13]，在進(jìn)一步的研究中，我們將考慮進(jìn)一步構(gòu)建pIL-6與S基因的真核雙表達(dá)質(zhì)粒，從而便于使用減毒沙門氏菌同時(shí)傳遞細(xì)胞因子佐劑與抗原編碼基因，從而進(jìn)一步提高口服TGEV DNA疫苗的免疫效果。

[1]Van Snick J.Interleukin-6:an overview[J].Annu Rev Immunol,1990,8:253-278.

[2]Ramsay A J,Husband A J,Ramshaw I A,et al.The role of interleukin-6in mucosal IgA antibody responses in vivo[J].Science,1994,264(5158):561-563.

[3]Mule J J,Custer M C,Travis W D,et al.Cellular mechanisms of the antitumor activity of recombinant IL-6in mice[J].J Immunol,1992,148(8):2622-2629.

[4]Murtaugh M P,Baarsch M J,Zhou Ya-ling,et al.Inflammatory cytokines in animal health and disease[J].Vet Immunol Immunopathol,1996,54(1-4):45-55.

[5]Richards C D,Saklatvala J.Molecular cloning and sequence of porcine interleukin 6cDNA and expression of mRNA in synovial fibroblasts in vitro[J].Cytokine,1991,3(4):269-276.

[6]Nuntaprasert A,Mori Y,Fujita K,et al.Expression and characterization of the recombinant swine interleukin-6[J].Comp Immunol M icrobiol Infect Dis,2005,28(2):103-120.

[7]嚴(yán)琳，何啟蓋，陳煥春，等.豬IL-2與IL6的原核表達(dá)及其對(duì)偽狂犬病基因缺失疫苗的佐劑效應(yīng)研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36(10)：1213-1218.

[8]Wu Mei,Gao Rong,Meng M ing-Jie,et al.Regulating effects of porcine interleukin-6gene and CpG motifs on immune responses to porcine trivalent vaccines in mice[J].Res Vet Sci,2004,77(1):49-57.

[9]楊恒，曹三杰，黃小波，等.TGEV雙基因嵌合表達(dá)質(zhì)粒pVAX-S-N的構(gòu)建及體外表達(dá)[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29(3)：254-257.

[10]楊恒，黃小波，文心田，等.豬粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(pGM-CSF)基因的克隆與原核表達(dá)研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009，17(2)：206-211.

[11]Egan M A,Israel Z R.The use of cytokines and chemokines as genetic adjuvants for plasmid DNA vaccines[J].Clin Appl Immunol Rev,2002,2:255-287.

[12]Schwager J,Schulze J.Maturation of the mitogen responsiveness,and IL2and IL6production by neonatal swine leukocytes[J].Vet Immunol Immunopathol,1997,57(1-2):105-119.

[13]Yang Heng,Chao San-jie,Wen Xin-tian,et al.Intragastric adm inistration of attenuated Salmonella typhimurium harbouring transmissible gastroentritis coronavirus(TGEV)DNA vaccine induced specific antibody production[J].Vaccine,2009,27(37):5035-5040.