(延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院,陜西延安 716000)
腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的無(wú)限性和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是腫瘤最重要的特征,也是腫瘤治療失敗導(dǎo)致死亡的重要原因。已有許多證據(jù)表明,腫瘤組織在有氧條件下生長(zhǎng)緩慢,而在缺氧狀態(tài)下增殖迅速。因此,腫瘤組織內(nèi)是相對(duì)缺氧的。在這種缺氧狀態(tài)下,腫瘤細(xì)胞不僅對(duì)放化療的抗拒性增加,而且更具有侵襲性,易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。其原因可能是腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)低氧環(huán)境,在能量代謝、血管生成、糖酵解、凋亡、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等方面產(chǎn)生了一系列的變化。而低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)處于腫瘤細(xì)胞缺氧的中樞位置,是啟動(dòng)這一系列代謝和生物學(xué)行為改變的重要因子[1]。為此,2008年1月~2009年10月,我們探討了HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義?,F(xiàn)報(bào)告如下。
1.1 臨床資料 選擇延安大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診的胃癌組織蠟塊120份(胃癌組),其中患者男79例、女41例,年齡27 ~88(60.06 ±12.63)歲;組織類型:未分化和低分化82例,中分化和高分化38例;TNM分期(2003年美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)第6版pTNM分期):Ⅰ+Ⅱ期48例、Ⅲ+Ⅳ期72例;浸潤(rùn)深度:T1+T239例、T3+T481例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移66例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例;有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移50例,無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移70例。所有患者術(shù)前未接受放療及化療。同期選擇68份正常健康體檢者胃黏膜組織(對(duì)照組),經(jīng)病理證實(shí)為非胃癌胃黏膜。其中患者男45例、女23 例,年齡24~79(56.06 ±9.85)歲。兩組性別、年齡具有可比性。
1.2 檢測(cè)方法 采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行HIF-1α檢測(cè)。具體步驟:將石蠟包埋的標(biāo)本于切片機(jī)上行4 μm連續(xù)切片,二甲苯脫蠟后,乙醇中水化,3%的過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,EDTA修復(fù)液修復(fù),滴加HIF-1α一抗于4℃冰箱孵育過(guò)夜,PBS清洗,順序滴加二抗及三抗孵育并清洗,然后滴加DAB顯色、蘇木精復(fù)染、鹽酸乙醇水化,最后滴加中性樹膠封片。本實(shí)驗(yàn)以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,陽(yáng)性的乳腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照。染色結(jié)果判定:由病理科??漆t(yī)生獨(dú)立閱片,對(duì)照HE染色確定腫瘤細(xì)胞區(qū)域,于顯微鏡下計(jì)數(shù)。HIF-1α蛋白以胞質(zhì)或胞核呈棕黃色細(xì)顆粒為陽(yáng)性,在高倍鏡下(400×)隨機(jī)選擇5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,共計(jì)1 000個(gè),計(jì)算每張切片陽(yáng)性細(xì)胞百分率,無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為陰性(-),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為弱陽(yáng)性(+),10% ~50%為中度陽(yáng)性(++),>50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 HIF-1α在正常胃黏膜和胃癌組織中的表達(dá)HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)的黃色顆?;蜃攸S色顆粒見于細(xì)胞核及胞質(zhì)中,對(duì)照組胃黏膜組織中未見HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)。見圖1。胃癌組中,HIF-1α(-)35例、(+)14例、(++)41例、(+++)30例,總陽(yáng)性表達(dá)率為70.83%(85/120),與對(duì)照組比較 P <0.01。
2.2 HIF-1α的表達(dá)與胃癌臨床病理因素的關(guān)系見表1。
圖1 HIF-1α在胃組織中的表達(dá)(SP×100)
胃癌的早期診斷率低、總體預(yù)后差,長(zhǎng)期以來(lái)嚴(yán)重威脅著人民的生命健康。腫瘤組織微環(huán)境低氧是腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)因子,也是其治療效果差,易產(chǎn)生放、化療耐受性的原因。HIF-1α是介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因,是由HIF-1α及HIF-1β組成的異源性二聚體,HIF-1α是氧調(diào)節(jié)亞基,又是功能亞基,其蛋白水平和活性決定了HIF-1的活性;HIF-1β屬結(jié)構(gòu)亞基,在常氧和缺氧條件下均可表達(dá),而HIF-1α在氧濃度正常時(shí),雖然不斷合成,但是很快被泛素蛋白酶體系所降解,其表達(dá)量維持在較低水平,因而很難檢測(cè)到。當(dāng)氧濃度降低時(shí),HIF-1α的穩(wěn)定性升高,其降解過(guò)程受到抑制,轉(zhuǎn)位于核內(nèi)與HIF-1β結(jié)合形成有活性的 HIF-1,轉(zhuǎn)錄、翻譯水平則呈指數(shù)增加[2]。HIF-1作為轉(zhuǎn)錄因子具有廣泛的靶基因譜,可調(diào)控 40 余種基因的表達(dá)[3],如 VEGF、EPO、糖酵解酶類及MDR等,其功能涉及到腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控、糖代謝、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等多方面,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,并且能使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性。
表1 胃癌組織中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系
本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)了HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá),結(jié)果顯示,HIF-1α的表達(dá)見于腫瘤細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中,總陽(yáng)性表達(dá)率為70.83%,在正常組織中未見到表達(dá),與Cabuk等[4]的研究結(jié)果一致,提示HIF-1α可能在胃癌的發(fā)生過(guò)程中起一定作用。此外,HIF-1α增加了p53蛋白的穩(wěn)定性,通過(guò)p53介導(dǎo)的凋亡機(jī)制,使細(xì)胞對(duì)缺氧引起的死亡有更高的敏感性。Graeber等[5]研究證實(shí),野生型p53的缺失與缺氧介導(dǎo)的凋亡明顯減少有關(guān)。因此,HIF-1α可能通過(guò)p53的穩(wěn)定性支持缺氧介導(dǎo)的凋亡。在早期腫瘤形成階段,通過(guò)體細(xì)胞突變導(dǎo)致p53功能喪失和HIF-1α過(guò)表達(dá),從而減少凋亡刺激腫瘤形成。HIF-1α在胃癌組織中的表達(dá)存在著顯著的異質(zhì)性,主要表現(xiàn)為隨著胃癌分化程度的降低,其表達(dá)強(qiáng)度及陽(yáng)性率逐漸升高,未或低分化組HIF-1α表達(dá)率明顯高于中高分化組;在同一種胃癌組織內(nèi),分化較好的區(qū)域(如腺管樣結(jié)構(gòu)形成較多、癌細(xì)胞巢團(tuán)較大等)HIF-1α的表達(dá)較弱,在分化較差的區(qū)域(如腺管樣結(jié)構(gòu)形成較少、癌細(xì)胞巢團(tuán)小或呈彌漫分布等)其表達(dá)則較強(qiáng)。另外,在腫瘤壞死區(qū)周圍或腫瘤近邊緣區(qū)域,HIF-1α表達(dá)明顯增多,與Zhong等[6]研究結(jié)果一致。由此可見,HIF-1α的表達(dá)與胃癌的演進(jìn)、惡性程度高低有一定的關(guān)系。
腫瘤細(xì)胞的快速增殖必然導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)而誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá),癌細(xì)胞可能通過(guò)產(chǎn)生過(guò)量HIF-1α的,使之適應(yīng)這一缺氧環(huán)境。腫瘤細(xì)胞的快速增殖使得血管生長(zhǎng)相對(duì)滯后,HIF-1α的表達(dá)誘導(dǎo)了VEGF的表達(dá),導(dǎo)致腫瘤血管網(wǎng)的形成,這樣不僅為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)帶來(lái)了更多的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),更能為腫瘤的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移帶來(lái)了便利條件。研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α的表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān),抑制HIF-1α的表達(dá),腫瘤生長(zhǎng)以及血管生成同時(shí)受抑制[4,7~9]。本研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α 的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān),而這些因素恰恰是決定胃癌預(yù)后的主要指標(biāo)。因此,檢測(cè)HIF-1α的表達(dá)具有一定的臨床意義。
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