HPV16 E7 siRNA表達(dá)載體對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞生物學(xué)活性的影響

(1三峽大學(xué)分子生物研究所，湖北宜昌 443002;2三峽大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院;3湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院)

流行病學(xué)調(diào)查顯示，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)16型感染與宮頸癌的發(fā)生有密切關(guān)系。其編碼的E7蛋白與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和病毒復(fù)制的調(diào)控有關(guān)，能在宮頸癌組織內(nèi)及細(xì)胞系持續(xù)表達(dá)，在維持轉(zhuǎn)化組織惡性表型的過(guò)程中具有重要作用［1］。因此，以E7基因?yàn)榘悬c(diǎn)的宮頸癌基因治療已成為研究熱點(diǎn)。RNA干擾(RNAi)技術(shù)是一種封閉基因表達(dá)的有效方法，能通過(guò)小干擾RNA(siRNA)或小發(fā)夾RNA來(lái)介導(dǎo)RNAi作用［2］。2011年7月 ～2012年2月，我們探討了HPV16 E7 siRNA表達(dá)載體對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞生物學(xué)活性的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細(xì)胞株CaSki、載體pSilenceU6由本研究所保存。Trizol總RNA純化試劑和LipofectamineTM2000購(gòu)自 Invitrogen公司;限制性?xún)?nèi)切酶、T4連接酶及Taq DNA聚合酶均購(gòu)自Fermentus公司。兔抗HPV16 E7單抗和β-acting鼠抗人多克隆抗體購(gòu)自Santa cruz。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司。EPICSXL-4流式細(xì)胞儀為Beckman Coulte公司產(chǎn)品，PCR引物合成及DNA測(cè)序由上海生工公司完成。GelLogic-200凝膠圖像分析儀為美國(guó)Kodak公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 將人宮頸癌CaSki細(xì)胞置于含10%小牛血清及1%青霉素(或鏈霉素)的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃、80%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳代方法:PBS潤(rùn)洗后，胰蛋白酶消化至輕拍細(xì)胞脫落;用培養(yǎng)液終止后轉(zhuǎn)至15 mL離心管，800 r/min離心3 min，棄上清液;細(xì)胞用培養(yǎng)液重懸后，以1∶3的比例傳代。

1.2.2 HPV16 E7特異性siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建利用 Ambion網(wǎng)站 siRNA Designer設(shè)計(jì)靶向HPV16 E7 siRNA靶序列，采用BLAST軟件對(duì)選擇的靶序列進(jìn)行同源分析，從HPV16 E7 mRNA基因中選擇一段19個(gè)堿基的E7特異性序列，設(shè)計(jì)1對(duì)63 bp的寡核苷酸，包括內(nèi)切酶位點(diǎn)及莖環(huán)結(jié)構(gòu)。HPV16 E7 siRNA靶序列上游引物:5'-GATCCGCAACAGTTACTGCGACGTTTCAAGAGAACGTCGCAGTAACTGTTGCTTTTTTGGAAA-3';下游引物:5'-AGCTTTTCCAAAAAAGCAACAGTTACTGCGACGTTCTCTTGAAACGTCGCAGTAACTGTTGCG-3'。對(duì)照序列中上游引物:5'-GATCCGTGACTAGCAACGTCGTACTTCAAGAGAGTACGACGTTGCTAGTCACTTTTTTGGAAA-3';下游引物:5'-AGCTTTTCCAAAAAAGTGACTAGCAACGTCGTACTCTCTTGAAGTACGACGTTGCTAGTCACG-3'。所得引物的cDNA片段克隆入經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ酶切的真核轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒載體pSilenceU6中。用分子克隆技術(shù)獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒pSilenceU6 HPV16 E7(E7Si)以及亂碼對(duì)照質(zhì)粒pSilenceU6 HPV16 E7-ctl(Si)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選 待CaSki細(xì)胞貼壁覆蓋率70% ～90%時(shí)，將表達(dá)載體E7Si及空載體Si按LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過(guò)潮霉素(0.8 mg/mL)抗性篩選，轉(zhuǎn)染20 d后分別得到抗性克隆細(xì)胞CaSki-E7Si及陰性對(duì)照CaSki-Si。

1.2.4 RT-PCR法檢測(cè)HPV16 E7 mRNA的表達(dá)用0.8 mL Trizol試劑裂解細(xì)胞，轉(zhuǎn)至無(wú)RNase的1.5 mL EP管中;加入160 μL氯仿，顛倒混勻，室溫靜置10 min，待兩液相分層后，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液至新的EP管中;加異丙醇500 μL，顛倒混勻，室溫靜置10 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清液;加75%乙醇(DEPC水配制)1 mL，洗滌沉淀，4℃ 7 500 r/min離心5 min后，棄上清液并風(fēng)干，用適量去RNase水溶解沉淀，獲得細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)體系得到cDNA。再以此cDNA第1鏈為模板，以β-actin和HPV16 E7為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)鑒定克隆細(xì)胞HPV16 E7的表達(dá) 將在mRNA水平沉默較好的CaSki-E7Si以及空載的CaSki-Si細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待長(zhǎng)到80% ～90%用胰酶消化分別收集細(xì)胞，各用3 mL PBS重懸，每種細(xì)胞分裝到2個(gè)流式管中，每管各取1 mL再次用3.5 mL PBS 洗滌，800 r/min 離心 3 min，去上清;用0.1%TritonX-100-PBS室溫處理10 min，PBS洗滌3次(2 000 r/min離心5 min)，去上清;將HPV16 E7的抗體按1∶800稀釋?zhuān)抗苤懈骷尤?00 μL，在室溫下孵育30 min。用PBS洗滌3次(2 000 r/min離心5 min)，將FITC標(biāo)記的二抗按1∶500稀釋?zhuān)抗苤屑尤?00 μL，室溫下避光孵育30 min。最后用PBS洗滌3次(2 000 r/min離心3 min)，用500 μL的PBS重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6 細(xì)胞增殖的檢測(cè) 分別收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期空載CaSki-Si和CaSki-E7Si的克隆細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL后接種于96孔板中，每孔100 μL。待細(xì)胞完全貼壁后，去培養(yǎng)液，加入100 μL MTT(200 μg/mL)，置于37 ℃孵育4 h，去上清液，加入DMSO 200 μL/孔，待完全溶解后于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度(OD)值，以此檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)作為0 h。用同樣方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72和96 h各時(shí)間點(diǎn)的OD值，以各時(shí)間點(diǎn)的OD值與0 h OD值的比值反映細(xì)胞生長(zhǎng)速度。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和化療藥物的敏感性 ①將空載CaSki-Si和CaSki-E7Si的克隆細(xì)胞分在6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)到70% ～80%用胰酶消化收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞存放于EP管中，用PBS混勻，2 500 r/min離心5 min，吸去上清廢液，用80%的乙醇(PBS配制)4℃固定。次晨取出固定好的細(xì)胞，2 500 r/min離心5 min后吸去上清廢液;再次加入PBS于EP管中混勻，2 500 r/min離心5 min后吸凈廢液，用500 μL含0.1%TritonX-100和50 μg/mL RNase的PBS混合液重懸細(xì)胞，然后加入0.5 mg/mL碘化丙錠90 μL，于37℃避光保溫30 min;尼龍膜過(guò)濾，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。②將起始濃度為900 ng/mL順鉑(DDP)3倍梯度稀釋3個(gè)濃度備用;待鋪在6孔板中空載CaS-ki-Si和CaSki-E7Si的克隆細(xì)胞貼壁后，加入上述3個(gè)濃度的DDP培養(yǎng)液，再次培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。按上述方法檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16 E7 siRNA的構(gòu)建 將用分子克隆技術(shù)成功篩選出的重組質(zhì)粒pSilenceU6 HPV16 E7和亂碼對(duì)照的pSilenceU6 HPV16 E7-ctl送上海生工測(cè)序。該重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序分析證實(shí)，重組質(zhì)粒中插入的片段方向正確，堿基無(wú)突變。

2.2 克隆細(xì)胞株的鑒定 將獲得的空載CaSki-Si和CaSki-E7Si的克隆細(xì)胞株放大培養(yǎng)后，在蛋白和mRNA水平上篩選穩(wěn)定沉默HPV16 E7表達(dá)的細(xì)胞株。結(jié)果顯示，在所得的陽(yáng)性克隆株HPV16-E7Si中，HPV16-E7Si-1在mRNA(圖1泳道3)和蛋白水平上(圖2)的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照細(xì)胞株空載Si。

圖1 mRNA水平鑒定HPV6 E7在克隆細(xì)胞株的表達(dá)

2.3 克隆細(xì)胞株活性的檢測(cè)

2.3.1 沉默HPV16 E7基因?qū)aSki細(xì)胞增殖的影響 用MTT比色法檢測(cè)克隆細(xì)胞株E7Si與對(duì)照Si的增殖速率。結(jié)果顯示，從培養(yǎng)48 h開(kāi)始，克隆細(xì)胞株的生長(zhǎng)要明顯慢于對(duì)照細(xì)胞Si(P＜0.05)，提示沉默HPV16 E7基因后抑制CaSki細(xì)胞增殖。見(jiàn)圖3。

2.3.2 沉默HPV16 E7基因?qū)aSki細(xì)胞周期的影響 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)沉默HPV16 E7基因后對(duì)CaSki細(xì)胞周期的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，克隆細(xì)胞株E7Si凋亡峰比例明顯增多(40.9%vs 7.03%，P ＜0.01)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CaSki細(xì)胞中E7蛋白的沉默

圖3 沉默HPV16 E7基因?qū)aSki細(xì)胞增殖的影響

2.3.3 沉默HPV16 E7基因后對(duì)DDP敏感性的影響 將起始濃度為900 ng/mL的DDP稀釋后作用于克隆細(xì)胞E7Si和對(duì)照空載Si細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DDP對(duì)HPV16 E7基因沉默后細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示，克隆細(xì)胞株E7Si G0～1期細(xì)胞明顯增多，阻止細(xì)胞于 DNA的合成前期，而對(duì)照Si則更多地是阻止細(xì)胞于合成期(S+G2+M)(P ＜0.05)。見(jiàn)表1、2。

表1 DDP對(duì)CaSki-E7Si細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響(%，±s)

表1 DDP對(duì)CaSki-E7Si細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響(%，±s)

注:與 CaSki-E7Si比較，*P ＜0.05

濃度 Sub G0～1 S G2+M CaSki-E7Si 40.9 ±7.11 31.0 ±3.88 5.2 ±0.64 12.5 ±1.06 DDP 900 ng/mL 5.8 ±1.73 53.0 ±6.03* 7.0 ±0.88 23.4 ±2.93*DDP 300 ng/mL 9.5 ±1.19 49.3 ±6.16* 8.0 ±1.20 21.6 ±2.79*DDP 100 ng/mL 17.1 ±1.14 36.7 ±4.59 8.1 ±1.01 17.4 ±2.08

3 討論

宮頸癌是婦科常見(jiàn)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女生殖健康和生命。研究表明，高危型HPV感染，尤其是16型和18型感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的最主要因素［3，4］，病毒早期基因E7可在宮頸癌組織中持續(xù)表達(dá)，并為癌組織惡性表型的維持所必需［3，5，6］。因此，抑制E7基因在宮頸癌中的過(guò)度表達(dá)，可以為宮頸癌的基因治療提供新的線索。

表2 DDP對(duì)CaSki-Si細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響(%，±s)

表2 DDP對(duì)CaSki-Si細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響(%，±s)

注:與 CaSki-Si比較，*P ＜0.05

濃度 Sub G0～1 S G2+M CaSki-Si 7.0 ±0.58 57.5 ±7.19 6.3 ±0.84 14.6 ±1.83 DDP 900 ng/mL 6.5 ±0.61 13.6 ±2.70 35.8 ±4.48* 18.3 ±2.09 DDP 300 ng/mL 4.3 ±0.54 18.6 ±2.33 10.4 ±1.30 45.9 ±5.04*DDP 100 ng/mL 6.4 ±0.61 22.6 ±2.13 7.4 ±0.93 37.2 ±4.60*

目前RNAi技術(shù)已成為基因功能研究和抗病毒治療的強(qiáng)有力工具［7，8］。本研究采用載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)觀察其對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞HPV16 E7基因的影響。本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一條HPV16 E7特異性Si和一條隨機(jī)亂碼Si作為對(duì)照，與其他核苷酸鏈無(wú)明顯同源性，保證了該siRNA對(duì)E7基因mRNA的特異性。構(gòu)建HPV早期基因E7的siRNA的真核載體，轉(zhuǎn)染到CaSki細(xì)胞中，有效沉默靶基因E7的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，轉(zhuǎn)染的非特異siRNA對(duì)靶基因未見(jiàn)明顯的抑制效應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了siRNA的作用具有特異性。用脂質(zhì)體直接轉(zhuǎn)染的方法，簡(jiǎn)單易行，且 LipofectamineTM2000在多種細(xì)胞轉(zhuǎn)染中均表現(xiàn)出穩(wěn)定、高效、低毒的特點(diǎn)。上述研究結(jié)果初步表明，siRNA載入CaSki細(xì)胞的活性有可能成為治療HPV相關(guān)腫瘤的一種新的手段，并為深入探討E7編碼基因在HPV相關(guān)腫瘤中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HPV16 E7 siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宮頸癌CaSki細(xì)胞后，凋亡明顯增加;但是加用DDP作用于空載Si和HPV16 E7Si細(xì)胞株后，DDP將空載 Si的周期阻滯在 S～G2期，而將 HPV16 E7Si細(xì)胞大部分阻滯在 G0～1期，說(shuō)明E7 siRNA表達(dá)載體在化療藥物的作用下能阻滯CaSki細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期。同時(shí)由生長(zhǎng)曲線可以看出，HPV16 E7 siRNA表達(dá)載體可使CaSki細(xì)胞生長(zhǎng)增殖減慢，而空載體卻無(wú)此作用。說(shuō)明E7 siRNA表達(dá)載體可抑制其細(xì)胞增殖。分析可能原因如下:①E7基因作為一種癌基因，其主要致癌機(jī)制為E7編碼蛋白干擾視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)與E2F的結(jié)合，使pRb-E2F復(fù)合物解離，E2F被游離，從而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用，使細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)節(jié)失控，發(fā)生永生化［9］;②DDP是鉑的金屬絡(luò)合物，其主要靶點(diǎn)為DNA，破壞其復(fù)制而發(fā)揮細(xì)胞毒作用［10］。細(xì)胞通過(guò)2個(gè)限制點(diǎn)(G1/S期和G2/M期限制點(diǎn))保證細(xì)胞的復(fù)制。且有研究表明，細(xì)胞周期的阻滯與細(xì)胞凋亡、分化密切相關(guān)。

綜上所述，HPV16 E7 siRNA表達(dá)載體可通過(guò)有效抑制宮頸癌CaSki細(xì)胞E7基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，從而部分逆轉(zhuǎn)其惡性表型，并且增加了DDP的敏感性。因此，通過(guò)RNAi干擾聯(lián)合化療可為腫瘤治療提供新的思路。

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