瞿茹怡,徐玉梅,鄭 潔,陸 詠
(上海市第一人民醫(yī)院分院,上海200092)
類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病,其發(fā)病率為20/ 10萬~50/10萬[1],女性多于男性。臨床研究顯示,75%的女性RA患者在妊娠期間癥狀緩解,尤其在妊娠最后3個月癥狀明顯改善;90%的RA患者在分娩后數(shù)周或數(shù)月血清類風濕因子(RF)升高;口服避孕藥可緩解病情。這些研究結(jié)果表明,雌激素在RA發(fā)病中具有重要作用。雌激素主要通過雌激素受體(ER)發(fā)揮作用,因而ER基因多態(tài)性可能影響雌激素的作用,進而影響RA的發(fā)病和臨床表現(xiàn)。2008~2011年,我們觀察了 RA患者 ER基因rs2234693和rs9340799位點多態(tài)性與RA的關(guān)系。現(xiàn)報告如下。
1.1 臨床資料 選擇在我院診治的女性RA患者160例(觀察組),年齡(56.43±9.22)歲,均符合美國風濕病學學會1987年修訂的RA診斷標準。同期選擇我院健康體檢女性150例作為對照組,年齡(57.31±9.92)歲。兩組年齡比較具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 臨床資料收集 所有研究對象入院當天詢問病史,包括年齡、起病年齡、病程、關(guān)節(jié)腫痛個數(shù)、關(guān)節(jié)畸形個數(shù)、晨僵情況等。次日晨抽空腹血10 mL,同步留取EDTA抗凝的全血1 mL。全血經(jīng)離心分離血漿和血細胞后,-80℃冰箱凍存。取血漿采用透射比濁法檢測RF;血細胞用于抽提DNA。
1.2.2 ER基因型分析 ①DNA抽提:選擇DNA抽提試劑盒(天根生化科技有限公司),嚴格按說明書操作,步驟簡述如下:血細胞經(jīng)裂解后,上硅膠膜吸附柱,然后經(jīng)洗滌、洗脫等步驟,獲得較純的DNA樣品,再用紫外分光光度計(Eppendorf,德國)測定濃度。②目的序列的PCR擴增和測序:根據(jù)Gene-Bank提供的ER基因序列,用Primer Express2.0軟件設(shè)計引物(引物由上海生工合成),ER基因多態(tài)性位點rs2234693(C/T)和rs9340799(A/G)位點測序的引物序列:上游引物:5'-ACAATTCTCCTGCTTTGGCC-3',下游引物:5'-GAGACCAATGCTCATCCCAAC-3';PCR反應條件:95℃預變性5 min,94℃30 s,62℃ 40 s,72℃ 60 s。共35個循環(huán),最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送華大基因公司測序。
1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件,等位基因頻率采用直接計數(shù)法,Hardy-Weinberg檢驗證實有群體代表性。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗,計量資料比較采用t檢驗和方差分析,非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 ER基因rs2234693、rs9340799位點測序結(jié)果兩組均經(jīng)測序分型,結(jié)果見圖1。rs2234693位點在兩組中存在C或T兩種變異(左側(cè)第6個堿基),其基因型分別為TT、CT、CC型;rs9340799位點在兩組中存在A或G兩種變異(右側(cè)第6個堿基),其基因型分別為AA、AG、GG型。
2.2 兩組ER基因rs2234693和rs9340799位點多態(tài)性比較 根據(jù)SNP位點rs2234693、rs9340799的基因型,2個位點排列組合,可得9種基因型:CC/ GG、TG/GG、TT/GG、CC/GA、TC/GA、TT/GA、CC/ AA、TC/AA和TT/AA。兩組基因型比較見表1。
圖1 ER基因rs2234693和rs9340799位點測序結(jié)果
2.3 兩組ER等位基因和基因型比較 見表2。
2.4 觀察組ER基因型與RA臨床表現(xiàn)的關(guān)系GG、AG、AA、CC、TC、TT六種基因型在起病年齡、病程、關(guān)節(jié)腫痛數(shù)和關(guān)節(jié)畸形數(shù)、晨僵和RF陽性率均無統(tǒng)計學意義。見表3。
2.5 觀察組ER基因型多態(tài)性與RA臨床表現(xiàn)的關(guān)系 CC/GG、TG/GG、TT/GG、CC/GA、TC/GA、TT/ GA、CC/AA、TC/AA和TT/AA九種基因型與起病年齡、病程、關(guān)節(jié)腫痛數(shù)、晨僵和RF陽性率無統(tǒng)計學意義。關(guān)節(jié)畸形數(shù)TT/GA型少于CC/GG、TG/GG、TC/GA、CC/AA、TC/AA和TT/AA型,其他基因型間無統(tǒng)計學意義。由于各組例數(shù)較少,TT/GA型僅有8例,這種差異是否有臨床意義,需進一步擴大樣本驗證。見表4。
表1 兩組ER基因rs2234693(C/T)和rs9340799(A/G)位點多態(tài)性比較[例(%)]
表2 兩組ER等位基因和基因型比較[例(%)]
表3 觀察組ER基因型與RA臨床表現(xiàn)的關(guān)系
表4 觀察組ER基因多態(tài)性與RA臨床表現(xiàn)的關(guān)系
RA是一類關(guān)節(jié)軟組織的慢性炎癥性疾病,其發(fā)病機制目前尚未完全闡明。多數(shù)研究認為與遺傳、環(huán)境等多因素有關(guān);其中遺傳因素有HLA-DRB1和PTPN22等基因,環(huán)境因素包括吸煙、感染等。
臨床研究發(fā)現(xiàn),雌激素在RA發(fā)病中具有重要作用,其通過與ER結(jié)合發(fā)揮生物學效應。因此,ER基因多態(tài)性和變異性將影響雌激素的作用。研究發(fā)現(xiàn),ER多態(tài)性(尤其是ERa的基因多態(tài)性)可能與乳腺癌、血脂代謝異常、動脈粥樣硬化和骨質(zhì)疏松等有關(guān)。目前,關(guān)于ER多態(tài)性與RA的相關(guān)性研究較少。
人體ER基因位于染色體6q24~27區(qū)域,由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成,全長140 kb,編碼一個相對分子質(zhì)量為66 kD的蛋白質(zhì)。ER位于胞核或胞質(zhì)內(nèi),與雌激素結(jié)合后,具有轉(zhuǎn)錄因子的作用。ER與雌激素結(jié)合后轉(zhuǎn)位至核內(nèi),與靶基因中的雌激素反應元件特異性結(jié)合,調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn),1號內(nèi)含子具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能,該區(qū)域堿基的改變(SNP或突變)會影響ER的表達和功能。據(jù)報道[2],1號內(nèi)含子中rs2234693(C/T)和rs9340799(A/G)位點多態(tài)性與ER的表達和功能有關(guān),可影響雌激素的作用。
國內(nèi)外的研究顯示,ER基因 rs2234693和rs9340799位點多態(tài)性與多種疾病有關(guān),如乳腺癌、骨質(zhì)疏松癥以及復發(fā)性流產(chǎn)等[3]。Ushiyama等[4]發(fā)現(xiàn),日本女性ERa PPxx基因型較XXPP、xxpp基因型RA發(fā)病早;同時還發(fā)現(xiàn),ER基因rs2234693和rs9340799位點的不同亞型與RF及類風濕結(jié)節(jié)的出現(xiàn)無明顯相關(guān)性。Takagi等[5]研究發(fā)現(xiàn),ER基因亞型雖與RA的發(fā)病年齡、RF陽性率以及腕骨的骨密度變化無明顯相關(guān)性,但與RA的發(fā)病有關(guān)。國內(nèi)蘇茵等研究發(fā)現(xiàn),我國女性RA的發(fā)病與ER基因XbaⅠ和PvuⅡ酶切多態(tài)性存在密切的相關(guān)性,其通過分析RA患者ER基因的多態(tài)性發(fā)現(xiàn),X和P的基因頻率表達明顯增高。說明這兩種等位基因可能與RA發(fā)病有一定的關(guān)系。
本研究發(fā)現(xiàn),觀察組CC/GG的基因型陽性率顯著高于對照組,TT/AA基因型的陽性率顯著低于對照組,其他基因型兩兩比較無統(tǒng)計學意義;觀察組C和G等位基因明顯高于對照組,GG和CC基因型也顯著高于對照組,而AA和TT基因型明顯低于對照組;2個位點的雜合型在組間沒有差異。表明C和G等位基因可能是RA發(fā)病的危險因素,而A和T等位基因可能是保護因素。分析GG、AG、AA、CC、TC、TT六種基因型,可見起病年齡、病程、關(guān)節(jié)腫痛數(shù)和關(guān)節(jié)畸形數(shù)、晨僵和RF陽性率在組間均未見顯著差異,提示ER基因rs2234693和rs9340799位點多態(tài)性與RA的發(fā)病有關(guān),而與病情嚴重程度無關(guān)。進一步分析CC/GG、TG/GG、TT/GG、CC/GA、TC/GA、TT/GA、CC/AA、TC/AA和TT/AA九種基因型多態(tài)性與起病年齡、病程、關(guān)節(jié)腫痛數(shù)和關(guān)節(jié)畸形數(shù)、晨僵和RF陽性率之間的關(guān)系,組間亦未見顯著差異。這和前人的研究結(jié)果[5,6]基本一致。表明ER rs2234693和rs9340799兩個位點的基因多態(tài)性可能僅與RA的發(fā)病有關(guān)。關(guān)節(jié)腫痛數(shù)和關(guān)節(jié)畸形數(shù)、晨僵和RF陽性率等可能有多種因素參與有關(guān),如炎癥因子(TNF-a,IL-6及其受體)[7,8]、治療時間及治療方案等。
總之,ER基因rs2234693和rs9340799位點的多態(tài)性與RA的發(fā)病相關(guān),雌激素在RA的發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要作用。
[1]Tobón GJ,Youinou P,Saraux A.The environment,geo-epidemiology,and autoimmune disease:Rheumatoid arthritis[J].Autoimmun Rev,2010,9(5):A288-A292.
[2]Smith EP,Boyd J,F(xiàn)rank GR,et al.Estrogen resistance caused by a mutation in the estrogen-receptor gene in a man[J].N Engl J Med,1994,331(16):1056-1061.
[3]Rice LW,Jazaeri AA,Shupnik MA.Estrogen receptor mRNA splice variants in pre-and postmenopausal human endometrium and endometrial carcinoma[J].Gynecol Oncol,1997,65(1):149-157.
[4]Ushiyama T,Mori K,Inoue K,et al.Association of oestrogen receptor gene polymorphisms with age at onset of rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis,1999,58(1):7-10.
[5]Takagi H,Ishiguro N,Iwata H,et al.Genetic association between rheumatoid arthritis and estrogen receptor microsatellite polymorphism[J].J Rheumatol,2000,27(7):1638-1642.
[6]Dziedziejko V,Kurzawski M,Safranow K,et al.Oestrogen receptor polymorphisms in female patients with rheumatoid arthritis[J].Scand J Rheumatol,2011,40(5):329-333.
[7]Emery P,Keystone E,Tony HP,et al.IL-6 receptor inhibition with tocilizumab improves treatment outcomes in patients with rheumatoid arthritis refractory to anti-tumour necrosis factor biologicals:results from a 24-week multicentre randomised placebo-controlled trial[J].Ann Rheum Dis,2008,67(11):1516-1523.
[8]Nishimoto N,Terao K,Mima T,et al.Mechanisms and pathologic significances in increase in serum interleukin-6(IL-6)and soluble IL-6 receptor after administration of an anti-IL-6 receptor antibody,tocilizumab,in patients with rheumatoid arthritis and Castleman disease[J].Blood,2008,112(10):3959-3964.