TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與癲癇的研究進展①

歐陽龍強 綜述 梁日生 楊衛(wèi)忠 審校 (福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科研究所，福州350001)

癲癇(Epilepsy，EP)是一組由大腦神經(jīng)元異常放電所引起的以短暫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)功能失常為特征的慢性腦部疾病。海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)對癲癇最敏感的腦區(qū)之一，癲癇發(fā)作可引起海馬特定區(qū)域(如 CA1、CA3)神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死［1］，引起學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知損害，給病人的生活和工作造成極大影響。我國的癲癇患者約有900萬，其中約75% ～80%可用藥物控制癥狀。但仍有20%～25%的患者無法用藥物控制發(fā)作而成為難治性癲癇。臨床上治療癲癇的藥物療效并不滿意，這說明需進一步研究癲癇的發(fā)病機制及治療機理，為臨床治療提供新的思路和手段。免疫炎癥反應(yīng)在癲癇發(fā)生與進程中起重要作用。研究顯示即使沒有感染存在，受損或應(yīng)激狀態(tài)細(xì)胞發(fā)出的信號也能引發(fā)免疫反應(yīng)［2］。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一個重要的天然免疫受體，它不僅能介導(dǎo)脂多糖等外源性配體引起炎癥反應(yīng)，還能介導(dǎo)受損或應(yīng)激產(chǎn)生的內(nèi)源性配體引發(fā)炎癥反應(yīng)。TLR4介導(dǎo)的信號通路能識別內(nèi)源性配體參與癲癇所致炎癥反應(yīng)，其具體作用機制尚不完全清楚。

1 TLR家族及其功能

1.1 Toll樣受體及其配體 Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)最早由 Medzhitov 等［3］1997 年在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，因其胞外段與一種果蠅蛋白Toll同源而命名為Toll樣受體，至今已發(fā)現(xiàn)11種人TLRs和13種小鼠TLRs［4］，它們是宿主細(xì)胞識別各種微生物致病源的天然受體。

TLRs是一類跨膜模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)受體，分胞外、胞膜和胞內(nèi)三部分。其胞外區(qū)是富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)的功能區(qū)，可通過識別不同的病原體相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern，PAMP)引發(fā)機體固有免疫應(yīng)答。胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)類似IL-1受體，故稱為Toll/IL-1同源結(jié)構(gòu)域(TIR)，是一種高度進化保守的結(jié)構(gòu)域，它介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答的信號啟動。TLRs主要表達于單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞。根據(jù)TLRs在細(xì)胞表達部位的不同分為兩類，一類是存在于細(xì)胞膜上的 TLRl、2、4、5、6、10，其配體主要為細(xì)菌產(chǎn)物，其中TLR2常與TLRl或TLR6形成二聚體，識別革蘭陽性菌的脂蛋白、肽聚糖和脂肽以及支原體的脂肽和真菌的酵母多糖［5，6］。TLR4則常協(xié)同MD-2和CD14識別革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖(LPS)，TLR5主要識別細(xì)菌的鞭毛蛋白分子［6］。另一類是 TLR3、7、8、9，主要表達于細(xì)胞內(nèi)，其主要識別病毒和細(xì)菌核酸。其中TLR3識別病毒雙鏈RNA(dsRNA)。TLR7和TLR8識別病毒分子中的單鏈RNA(ssRNA)，TLR9則對細(xì)菌和某些病毒的DNA上非甲基化的CPG基序起識別作用［6，7］。

TLRs除了識別上述介紹的外源性配體外，Matzinger［8］的“危險模式”理論提出體內(nèi)還可出現(xiàn)“內(nèi)源性危險信號”，這些危險信號主要是機體細(xì)胞損傷時產(chǎn)生的熱休克蛋白、抗菌素/防御素、氧自由基、胞外基質(zhì)降解產(chǎn)物、神經(jīng)介質(zhì)、細(xì)胞因子、DNA和RNA等物質(zhì)，這些危險信號主要來自損傷變性、壞死或者凋亡的細(xì)胞，它們已被證明可以作為TLR的配體，激活TLR信號通路從而引起炎癥反應(yīng)。即使沒有感染存在，受損及應(yīng)激狀態(tài)細(xì)胞發(fā)出的信號也可以引發(fā)免疫應(yīng)答，能識別內(nèi)源性“危險信號”目前已知的有 TLR2、TLR3、TLR4 和 TLR9。

1.2 Toll樣受體的功能 TLRs主要通過受體胞外段的TIR結(jié)構(gòu)域與病原體的PAMP或“內(nèi)源性危險信號”相結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，最終由進入胞核內(nèi)的活化NF-κB啟動核內(nèi)相關(guān)基因表達，促使 IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α 及 IFN-γ 等細(xì)胞因子合成與釋放，引起免疫細(xì)胞的激活并產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。此外，TLRs還具有促進免疫細(xì)胞膜表達相關(guān)免疫分子以及促進免疫細(xì)胞的成熟和活化等功能［9，10］。

2 TLR4

2.1 TLR4與MyD88的結(jié)構(gòu) TLR4作為細(xì)胞表面的模式識別受體，具有TLRs家族的結(jié)構(gòu)特征。它通過協(xié)同CD14和MD-2識別細(xì)菌脂多糖(LPS)、鞭毛蛋白、表面活性蛋白A等外源性配體，也可以識別內(nèi)源性配體，如熱休克蛋白 (HSPs)、HMGB1［11，12］。TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)通過激活基因轉(zhuǎn)錄編碼炎癥介質(zhì)的釋放產(chǎn)生［11］。MyD88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)本質(zhì)是一種胞質(zhì)可溶性蛋白，具有兩個特殊的結(jié)構(gòu)域，即N端特有的死亡結(jié)構(gòu)域(Death domain，DD)和 C 端保守的 TIR 結(jié)構(gòu)域［13］。N端的DD約有90個氨基酸組成，負(fù)責(zé)募集下游的含有DD的信號分子進入下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。C端的TIR域約有130個氨基酸組成，負(fù)責(zé)承接TLRs活化信號［6］。MyD88功能缺陷可導(dǎo)致信號傳導(dǎo)中斷。TLR4與相應(yīng)配體結(jié)合后介導(dǎo)MyD88依賴和非依賴兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2.2 TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

2.2.1 TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴信號通路 TLR4被LPS與內(nèi)源性配體(如 HMGB1)激活后，通過TIR-TIR結(jié)構(gòu)域募集MyD88樣接頭蛋白MAL(MyD88 adaptor-like protein，MAL)和 MyD88，MyD88通過其DD與IRAK(IL-1 receptor-associated kinase，IRAK)家族蛋白分子結(jié)合成為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物。激活的IRAK4、IRAK1、IRAK2磷酸化而脫離MyD88/IRAK 復(fù)合體［14，15］，與 TRAF6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)結(jié)合，TRAF6再依賴泛素激活TAK1(Transforming growth factorβ ～activated kinase，TAK1)復(fù)合體，活化的TAK1激活I(lǐng)KKα/IKKβ復(fù)合體，后者使核因子 NF-κB的抑制物 IκB(Inhihitory KappaB，IκB)磷酸化之后，再泛素化降解。游離的NF-κB進入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，激活I(lǐng)L-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、及 IFN-γ 等細(xì)胞因子的基因表達。同時，TAK1還可激活MAPK家族復(fù)合體，后者使AP-1活化后進入細(xì)胞核啟動基因表達［6，13-15］(如圖1)。

2.2.2 TLR4介導(dǎo)的 MyD88非依賴信號通路

TLR4通過激活 TRAM(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)與 TRIF(TIR domain containing adaptorinducing IFN-β，TIRF)結(jié)合?；罨蟮?TRIF募集IKKi/TBK1 復(fù)合體(復(fù)合體由 IKKi、TBK1、NAP1、TANK和兩個IRF3組成)，并使IRF3磷酸化進入細(xì)胞核調(diào)控 IFN ～ β 的合成［16，17］。同時，TRIF 還可結(jié)合受體作用蛋白(receptor inieraeting protein 1，RIp1)激活TRAF6和 FADD(FAS-associated death domain，F(xiàn)ADD)，從而誘導(dǎo)MAPK和NF-κB晚期的活化以及細(xì)胞凋亡［6，13］(如圖 1)。

圖1 TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Fig.1 TLR4 signalling pathways

3 癲癇與免疫炎癥反應(yīng)

3.1 癲癇引發(fā)免疫炎癥反應(yīng) 研究顯示，癲癇發(fā)作后可激活神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及大量炎癥介質(zhì)的釋放，包括白細(xì)胞介素類(ILs)、干擾素類(IFNs)、腫瘤壞死因子類(TNFs)，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)［18］。Ravizza 等［19］在顳葉癲癇患者手術(shù)切除的海馬中檢測到激活的小膠質(zhì)細(xì)胞、星型細(xì)胞以及IL-1b、IL-6、TNF-α等炎性指標(biāo)，而在正常對照組的標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)。Ferriero等［20］在海人酸誘導(dǎo)動物癲癇持續(xù)狀態(tài)24小時后可檢測到小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞的大量活化和炎癥因子的大量產(chǎn)生。Vezzani［21］對癲癇動物模型腦組織進行免疫組化發(fā)現(xiàn)，IL-1b、IL-6、TNF-α以及一些細(xì)胞因子受體最先在小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞中表達，隨后出現(xiàn)環(huán)加氧酶-2(COX-2)、前列腺素、補體系統(tǒng)等的表達上調(diào)。小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是腦內(nèi)的“巨噬細(xì)胞”，在固有免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用［22］，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌、釋放 IL-1b、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2 等促炎因子以及自由基ROS、RNS，并通過N-甲基D天冬氨酸受體信號傳導(dǎo)通路抑制神經(jīng)元的呼吸鏈，使神經(jīng)元中ATP急劇減少最終因能量衰竭而死亡，這種損傷又反饋促進癲癇的發(fā)作及增加其敏感度和持續(xù)時間。小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的促炎癥因子如IL-1b、IL-6、TNF-α還可活化星型膠質(zhì)細(xì)胞表達COX-2、INOS，產(chǎn)生氧自由基，釋放促炎癥細(xì)胞因子及一些神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF)參與炎癥反應(yīng)。炎性細(xì)胞因子與TLRs在誘導(dǎo)先天性和獲得性免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［21］。TLRs能識別損傷或應(yīng)激所致的“內(nèi)源性危險信號”作為配體，激活信號通路引起炎癥反應(yīng)［8］。癲癇可以通過“內(nèi)源性危險信號”激活TLRs，最終活化核因子-κB(Nudear factor kappaB，NF-κB)，促使 IL-1、IL-6、TNF-α、COX-2、INOS 等細(xì)胞因子合成與釋放。

3.2 免疫炎癥反應(yīng)參與癲癇的發(fā)生與發(fā)展 大腦內(nèi)的免疫炎性反應(yīng)可能是構(gòu)成癲癇發(fā)作與發(fā)展進程中的最重要機制之一［21，23，24］。炎癥反應(yīng)不僅是癲癇的一個結(jié)果，還可能是癲癇發(fā)作的原因之一［18］。研究顯示［21］神經(jīng)免疫炎性反應(yīng)不僅增加神經(jīng)元興奮性、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，還可破壞血-腦屏障，使外周免疫細(xì)胞與炎性物質(zhì)浸入到大腦，在高炎癥因子和高興奮性的病理情況下，谷氨酸攝取受抑制，神經(jīng)生長因子可引起軸突出芽，異常突觸形成，苔蘚纖維出芽及海馬硬化，形成顳葉癲癇樣病理變化，導(dǎo)致癲癇形成。Friedman等［24］均報道免疫炎癥介質(zhì)是介導(dǎo)癲癇發(fā)作和發(fā)展普遍的、重要的機制之一。目前雖然存在 IL-1b、IL-6、TNF-a、TLRs、前列腺素 E2(PGE2)以及補體系統(tǒng)對癲癇發(fā)作的產(chǎn)生和加重的證據(jù)，但其作用機制尚不清楚［25］。

4 TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與癲癇

癲癇發(fā)作時，TLR4在神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn)異常表達。Kleen等［11］發(fā)現(xiàn)TLR4在組織受損和應(yīng)激時被激活，加劇癲癇的發(fā)作。其主要著火點是HMGB1(High-mobility group box-1 HMGB1，)—— 一種染色質(zhì)成分，由病變或死亡的細(xì)胞釋放［12，23］。Maroso 等［12］在海人酸或荷包牡丹堿誘導(dǎo)的小鼠癲癇模型中觀察到，HMGB1與TLR4在海馬的神經(jīng)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞高度表達。隨后出現(xiàn)癲癇的大幅度增強。應(yīng)用HMGB1和TLR4拮抗劑后癲癇發(fā)作下降。TLR4缺陷的C3H/HJ型小鼠具有抵抗癲癇發(fā)作的功能［11，12］。Friedman 等［24］報道 TLR4、IL-1β、TNF-α在癲癇的產(chǎn)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，在某種程度上干預(yù)TLR4信號通路等免疫反應(yīng)能成功預(yù)防癲癇發(fā)作。由此可見，腦組織中的神經(jīng)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞表達的TLR4作為重要的炎性受體介導(dǎo)癲癇炎性損傷，并參與癲癇的產(chǎn)生和發(fā)展。癲癇發(fā)作可激活TLR4和炎性因子，活化后的TLR4、炎癥因子又參與癲癇的產(chǎn)生和發(fā)展，炎癥因子可通過TLR4信號通路介導(dǎo)的產(chǎn)生，三者之間形成一個循環(huán)通路。因此更深入地了解TLR4及其配體、相關(guān)蛋白的相互作用，將有助于開發(fā)調(diào)節(jié)TLR4信號通路的激動劑或拮抗劑，對于癲癇腦損傷的研究提供新的靶點和治療措施。

5 研究意義與展望

癲癇的發(fā)生機制復(fù)雜，其病理生理機制還不完全清楚，免疫炎癥反應(yīng)是癲癇的重要損傷機制之一。TLR4及其信號途徑是連接天然免疫和獲得性免疫重要橋梁之一。雖然癲癇與TLR4信號通路之間的關(guān)系還處于研究的初級階段，但對TLR4及其信號通路的深入了解將有助于我們進一步了解非病原微生物性炎癥機制及其分子基礎(chǔ)。從而更深刻的弄清癲癇的發(fā)病因素及其病理生理過程。為今后新的抗癲癇藥物研制等方面提供新的切入點，并為臨床治療開辟更加廣泛的途徑。

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