血管緊張素Ⅱ刺激血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)TSLP及信號(hào)通路研究①

趙 卉 何少林 林 靜 馬旭明 李大主

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，武漢430022)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種慢性免疫炎癥性疾病［1］。AngⅡ作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的主要成分，能夠刺激血管細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和生長因子通過受體介導(dǎo)方式及復(fù)雜的胞內(nèi)信號(hào)通路參與AS的炎癥反應(yīng)［2］，但具體機(jī)制尚不十分清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞(DC)的激活在AS形成發(fā)展過程中起著重要作用［3］。最近研究表明胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)是DC成熟活化的重要刺激因子［4，5］。支氣管平滑肌細(xì)胞在多種炎癥因子刺激下可表達(dá) TSLP，并介導(dǎo)支氣管炎癥反應(yīng)［6］。AngⅡ是否通過刺激血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表達(dá)TSLP而引發(fā)AS炎癥反應(yīng)尚無報(bào)道，本文就此進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(無碳酸氫鈉)及新生牛血清購于Gibco公司，培養(yǎng)基按說明書配制，4℃保存，血清使用前56℃水浴30分鐘滅活補(bǔ)體后分裝，-20℃保存;AngⅡ、PDTC購于Sigma公司;DMSO購于上海華美生物工程公司;胰蛋白酶購于Amersco公司;TSLP ELISA試劑盒購于R＆D公司;TSLP免疫組化試劑的一抗購于ProSci公司;兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒購于基因科技(上海)公司;EMSA試劑盒購于美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 VSMC培養(yǎng) 取 Sprague-Dawley雄性大鼠(150～180克，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)胸主動(dòng)脈，去除血管內(nèi)膜和外膜，將中膜剪成1 mm2大小的組織塊，貼片于培養(yǎng)皿底部，用含20%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞生長融合后，用0.125%胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)選用第4～10代培養(yǎng)細(xì)胞。倒置顯微鏡下見傳代細(xì)胞呈典型的“峰-谷”樣生長，免疫細(xì)胞化學(xué)染色見細(xì)胞內(nèi)α2肌動(dòng)蛋白呈陽性，確定為平滑肌細(xì)胞。

1.2.2 分組及處理 本實(shí)驗(yàn)共分3組:(1)對(duì)照組:正常培養(yǎng)的VSMC。(2)AngⅡ刺激組:①以不同濃度梯度(0.01、0.1、1 μmol/L)的 Ang Ⅱ刺激VSMC 6小時(shí);②用 AngⅡ(0.1μmol/L)分別刺激VSMC 3、6、12、24小時(shí)。(3)Ang Ⅱ +PDTC 組:先用PDTC 10μmol/L預(yù)處理VSMC 30分鐘后給予Ang Ⅱ(0.1 μmol/L)孵育3、6、12、24 小時(shí)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞中TSLP的表達(dá) 在6孔板內(nèi)預(yù)置一蓋玻片，接種VSMC(1×104/孔)，用AngⅡ和PDTC按上述方法對(duì)細(xì)胞加以刺激。將含有貼壁細(xì)胞的蓋玻片用0.01 mol/L PBS(pH=7.2～7.4)浸洗3次，4%多聚甲醛固定1小時(shí)，取出蓋玻片固定于載玻片上，PBS洗3次;0.1%Triton X-100反應(yīng)15分鐘;PBS洗3次;3%H2O2-甲醇封閉15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;PBS洗3次;甩去PBS液，滴加第一抗體;每張切片加入50 μl稀釋液，4℃過夜;PBS洗3次;甩去PBS液，每張切片加50～100μl A液，室溫下孵育45分鐘;PBS洗3次;每張切片加50～100μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡控制顯色。常規(guī)脫水、透明、封片。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗，其余步驟相同。用IPP對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行圖像分析，每張切片取5個(gè)不同視野，TSLP陽性表達(dá)用平均光密度(累計(jì)光密度IOD/細(xì)胞個(gè)數(shù)n)表示。

1.2.4 ELISA檢測(cè)上清液中TSLP濃度 操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.5 EMSA檢測(cè)VSMC NF-κB的結(jié)合活性 ①細(xì)胞核蛋白提取和探針標(biāo)記:收集上述各組VSMC，按文獻(xiàn)［7］的方法加以改良后提取核蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，-70℃保存?zhèn)溆?。含NF-κB結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈寡核苷酸探針序列為:5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3'，5'-GCC TGG GAA AGT CCC CTC AAC T-3'。在其3'末端進(jìn)行生物素標(biāo)記。②反應(yīng)體系:取等量核蛋白30μg，每組加入10×Binding Buffer 2 μl、1 μg/μl Poly(dI·dC)1 μl、50%Glycerol 1 μl、100 mmol/L MgCl21 μl、1%NP-40 1 μl、生物素標(biāo)記的探針1 μl，總體積20 μl，不足的用雙蒸水補(bǔ)齊。對(duì)于競爭性反應(yīng)，在此反應(yīng)體系中加入100倍濃度的非標(biāo)記探針1μl。加入非標(biāo)記探針后37℃一同孵育30分鐘，后各管加入標(biāo)記探針，37℃孵育15分鐘。各管加入5×Loading Buffer 5μl，混勻后上樣。用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電壓為100 V/cm。380 mA恒流30分鐘，將DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，紫外燈下交聯(lián)15分鐘。按試劑盒說明先后進(jìn)行封閉、孵育、洗膜，暗室中自顯影，使用美國UVP凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行攝像，IPP軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以上各組實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)值用±s表示，結(jié)果用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間數(shù)據(jù)根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步使用S-N-K檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AngⅡ及PDTC對(duì)VSMC胞漿中TSLP表達(dá)的影響 對(duì)照組VSMC胞漿淡染，幾乎無TSLP表達(dá)，AngⅡ刺激組胞質(zhì)內(nèi)均有不同程度的TSLP表達(dá)，呈棕黃色或黃色顆粒狀染色，且有濃度(0.01、0.1、1 μmol/L)和時(shí)間(3、6、12、24 小時(shí))依賴性。其中 1 μmol/L組及24小時(shí)組陽性細(xì)胞的數(shù)量最多，染色最深。AngⅡ +PDTC組，較AngⅡ組陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，染色程度降低，但較對(duì)照組仍有明顯增強(qiáng)。選取對(duì)照組;AngⅡ(0.1μmol/L)刺激12小時(shí);AngⅡ(0.1μmol/L)+PDTC(10 μmol/L)刺激12小時(shí)三組，如圖1:各組平均光密度依次為15.17±2.26、1 390.39 ±28.24、256.32 ±15.92。(三組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均P＜0.001)。

2.2 AngⅡ及PDTC對(duì)VSMC分泌TSLP的影響 Ang Ⅱ(0.01、0.1、1 μmol/L)刺激 VSMC 6 小時(shí)檢測(cè)上清中的TSLP濃度(圖2):AngⅡ各濃度刺激組上清液中的TSLP濃度顯著高于對(duì)照組(0μmol/L)(均 P ＜0.01)，0.01、0.1、1 μmol/L 三組相比，隨著AngⅡ濃度的升高上清中的TSLP濃度明顯增加［依次為(23.90 ±3.84)pg/ml、(51.05 ±6.77)pg/ml、(62.17 ±6.08)pg/ml，均 P ＜0.05］。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)VSMC中的TSLP表達(dá)Fig.1 Immunohistochemical staining analysis of the expression of TSLP in rat VSMC

圖2 不同濃度的AngⅡ刺激組上清液中的TSLP濃度Fig.2 Release of TSLP protein by VSMC exposed to AngⅡfor different concentrations

分別以 AngⅡ(0.1μmol/L)及 AngⅡ(0.1 μmol/L)+PDTC(10 μmol/L)刺激 VSMC 3 、6、12、24小時(shí)后檢測(cè)上清中TSLP濃度比較(圖3):AngⅡ(0.1μmol/L)各處理組與對(duì)照組(0小時(shí))相比，TSLP的濃度明顯增加(均P＜0.001)，并隨著刺激時(shí)間的延長濃度增大(均 P＜0.01);AngⅡ與 AngⅡ +PDTC兩種處理比較:3小時(shí)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。6、12、24 小時(shí)組:AngⅡ+PDTC 組 TSLP的濃度明顯低于AngⅡ處理組(均P＜0.001)。

2.3 AngⅡ刺激VSMC產(chǎn)生TSLP的同時(shí)上調(diào)NF-κB的結(jié)合活性 用AngⅡ(0.1μmol/L)及AngⅡ(0.1 μmol/L)+PDTC(10 μmol/L)刺激 VSMC 12小時(shí)，收集細(xì)胞，提取核蛋白，做EMSA結(jié)果(圖4):正常未經(jīng)處理的VSMC(圖4:Control)有基礎(chǔ)性的NF-κB活化，AngⅡ可以顯著增加NF-κB的結(jié)合活性，PDTC可明顯抑制這一作用?；叶戎当容^(圖4B):各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3 討論

AS是一種慢性免疫炎癥性疾?。?］。從早期各種危險(xiǎn)因素所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷到纖維斑塊的破裂，炎癥貫穿AS始終。近年來的基礎(chǔ)和臨床研究從AngⅡ、AT1受體拮抗劑、ACEI等多方面闡述了RAS系統(tǒng)尤其是 AngⅡ在AS炎癥中的作用機(jī)制［8］。AngⅡ可以上調(diào)粘附分子，炎癥趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，LDL的氧化攝取，平滑肌細(xì)胞增殖，在AS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［9］。目前研究認(rèn)為作為專職的抗原提呈細(xì)胞DC所介導(dǎo)的特異性免疫在AS進(jìn)展中也發(fā)揮著重要作用［3，10］。我們發(fā)現(xiàn) DC在AS患者中高度活化，并且在AS斑塊中大量聚集，與斑塊的不穩(wěn)定有關(guān)［3］。然而AngⅡ所介導(dǎo)的炎癥激活作用是否通過DC途徑產(chǎn)生目前還不清楚。

圖3 不同時(shí)間梯度的各刺激組上清液中TSLP的濃度Fig.3 Release of TSLP protein by VSMC exposed to AngⅡwith or without PDTC for different durations

圖4 EMSA檢測(cè)VSMC NF-κB結(jié)合活性Fig.4 The activation of NF-κB in primary rat VSMC exposed to AngⅡ

TSLP是一種結(jié)構(gòu)類似IL-7的新型細(xì)胞因子，主要表達(dá)于胸腺基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞。在免疫細(xì)胞(DC、T細(xì)胞、單核細(xì)胞等)及心臟，骨骼肌等組織中可檢測(cè)到TSLPR mRNA。該因子在DC的成熟活化及Th2和Treg的分化成熟中起著重要的調(diào)控作用，參與支氣管哮喘、特應(yīng)性皮炎、炎癥性腸病等免疫炎癥性疾病的進(jìn)展過程［5］。Zhang 等［6］證實(shí) IL-1β 和TNF-α可誘導(dǎo)HASMC TSLP的表達(dá)，在氣道炎癥反應(yīng)起重要作用。AngⅡ是否通過刺激VSMC產(chǎn)生TSLP，從而激活DC導(dǎo)致AS炎癥反應(yīng)尚無研究。本研究證實(shí)正常未經(jīng)處理的大鼠VSMC幾乎不表達(dá)TSLP，經(jīng)AngⅡ刺激后TSLP的表達(dá)及分泌量顯著升高，并有劑量和時(shí)間依賴性，說明AngⅡ可以刺激VSMC產(chǎn)生TSLP，有可能通過激活DC在AS的炎癥反應(yīng)中起作用。作為細(xì)胞內(nèi)主要的炎癥反應(yīng)信號(hào)通路NF-κB系統(tǒng)在AngⅡ介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。AngⅡ通過激活NF-κB刺激VSMC表達(dá)細(xì)胞粘附分子(如 VCAM-1、ICAM-1、E-選擇素)，炎癥趨化因子(如MCP-1)，細(xì)胞因子(如IL-6、IL-8)等介導(dǎo)血管炎癥，參與AS的形成和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相同條件下，AngⅡ可激活VSMC的NF-κB信號(hào)通路，可以提示我們AngⅡ很可能通過活化VSMC NF-κB，誘導(dǎo)TSLP表達(dá)。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)和DC在AS免疫炎癥反應(yīng)中均起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)表明AngⅡ可以刺激VSMC產(chǎn)生TSLP，其機(jī)制可能與上調(diào)NF-κB的結(jié)合活性有關(guān)。

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