腦膠質(zhì)瘤組織中內(nèi)皮抑素的表達及其與血管形成的關(guān)系①

陳 巖 倪朝輝 趙 剛 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，長春130041)

惡性膠質(zhì)瘤是高度血管化的腫瘤，內(nèi)皮細胞增殖所致新生血管的形成與膠質(zhì)瘤的惡性程度、生物侵襲性及臨床復(fù)發(fā)進程密切相關(guān)［1］。腫瘤新生血管形成是血管生成刺激因子與抑制因子共同調(diào)節(jié)、相互制衡的結(jié)果。已有較多研究報道證實:以VEGF為代表的多種血管生成刺激因子在惡性膠質(zhì)瘤組織中表達明顯升高。而對于負性調(diào)控因子，尤其是目前已知作用最強的內(nèi)源性血管生成抑制因子——內(nèi)皮抑素(Endostain，ES)在膠質(zhì)瘤腫瘤組織中的表達情況研究尚不多見，且已有研究結(jié)果也不盡一致［2，3］。因此，本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測不同級別的人腦膠質(zhì)瘤組織中內(nèi)皮抑素的表達及腫瘤微血管密度(MVD)，旨在進一步明確內(nèi)皮抑素蛋白水平與膠質(zhì)瘤新生血管形成的關(guān)系，為應(yīng)用抗血管生成療法治療腦膠質(zhì)瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的46例腦膠質(zhì)瘤患者。男31例，女15例，年齡15～64歲，平均41.6歲。其中Ⅰ級7例;Ⅱ級18例;Ⅲ級13例;Ⅳ級8例。同時取5例外傷后內(nèi)減壓術(shù)的非腫瘤患者腦組織標本作為正常對照組，標本經(jīng)10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，5μm厚組織切片。

1.2 腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)皮抑素及MVD表達檢測內(nèi)皮抑素單克隆抗體購自R＆D systems;免疫組化試劑盒購自福州邁新試劑公司。內(nèi)皮抑素主要表達于血管內(nèi)皮細胞及腫瘤細胞胞漿內(nèi)，以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽性。每張切片隨機觀察1個高倍鏡視野，計數(shù)500個細胞中陽性細胞的百分率:其中陽性細胞百分率＜5%記為(-)，5% ～20%記為(+)，21% ～50%記為(++)，百分率 ＞50%記為(+++);MVD檢測采用SP法進行CD34染色，在低倍鏡下尋找微血管最密集區(qū)，然后在400倍視野范圍內(nèi)計算5個視野下的微血管數(shù)，取其平均數(shù)作為該病例的MVD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS14.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)以±s表示;計數(shù)資料數(shù)據(jù)以百分率表示，率的差異性比較采用卡方檢驗率;等級資料率的差異性比較采用Wilcoxon秩和檢驗;以P＜0.05為差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮抑素在膠質(zhì)瘤組織中的表達情況 5例正常腦組織及46例各級別膠質(zhì)瘤組織中內(nèi)皮抑素表達陽性率見表1。腦膠質(zhì)瘤組織標本中，以內(nèi)皮細胞中內(nèi)皮抑素表達最為顯著(圖1A)。此外，在腫瘤細胞漿亦偶見內(nèi)皮抑素陽性表達，尤見于新生血管內(nèi)皮細胞周邊的腫瘤細胞(圖1B)。與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織中內(nèi)皮抑素表達百分率顯著增加(χ2=8.673，P=0.003 ＜0.01)。對內(nèi)皮抑素表達程度與膠質(zhì)瘤病理級別的關(guān)系行Spearman等級相關(guān)分析，顯示內(nèi)皮抑素在膠質(zhì)瘤血管內(nèi)皮細胞中的表達強度隨腫瘤惡性程度增高而增強。

2.2 腫瘤微血管密度(MVD)檢測 不同級別的膠質(zhì)瘤組織中MVD值見表2，各組間總體存在非常顯著性差異(χ2=33.204，P=0.00 ＜0.01)，進一步進行兩兩比較，除Ⅲ級與Ⅳ級之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義外(χ2=3.824，P=0.051 ＞0.05)，其余各級之間均存在非常顯著性差異(P值均小于0.003 3)。各級別膠質(zhì)瘤組織中MVD染色見圖2。

表1 膠質(zhì)瘤組織中內(nèi)皮抑素表達與腫瘤病理級別關(guān)系Tab.1 Relationship between Endostatin expression with tumor pathology grade in glioma tissues

圖1 膠質(zhì)瘤組織中內(nèi)皮抑素表達免疫組化檢測(×400)Fig.1 Immunohistochemical detection of endostatin in gliomas tissues(×400)

2.3 內(nèi)皮抑素表達強度與腫瘤MVD的關(guān)系 對表達不同強度內(nèi)皮抑素的膠質(zhì)瘤組織中的MVD情況進行分析發(fā)現(xiàn):隨著內(nèi)皮抑素蛋白表達強度的增加，MVD值呈上升趨勢(詳見表3)。

表2 膠質(zhì)瘤組織MVD與病理級別的關(guān)系Tab.2 Relationship between MVD with tumor pathology grade in glioma tissues

圖2 膠質(zhì)瘤組織CD34免疫組化檢測(×100)Fig.2 Immunohistochemical detection of CD34 in each grade glioma tissues(×100)

表3 膠質(zhì)瘤組織中內(nèi)皮抑素表達與MVD的關(guān)系Tab.3 Relationship between Endostatin expression with MVD in glioma tissues

3 討論

內(nèi)皮抑素是目前已知功能最強的血管生成抑制因子，能特異性地抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，從而有效地抑制血管生成和腫瘤生長［4］。目前的研究認為內(nèi)皮抑素并不是由腫瘤細胞直接產(chǎn)生的，而是由于機體受到腫瘤細胞通過多種途徑的刺激，激發(fā)血管生成，之后內(nèi)皮細胞產(chǎn)生蛋白水解酶，水解膠原ⅩⅧ的C末端中心蛋白酶敏感區(qū)，水解后釋放出大小不等的生物活性片段，即為內(nèi)皮抑素，并且通過血液循環(huán)到達腫瘤部位，抑制原發(fā)和繼發(fā)腫瘤血管的生成。

腦膠質(zhì)瘤是富含血管的腫瘤，惡性膠質(zhì)瘤如多形性膠質(zhì)母細胞瘤更以高度血管化和血管內(nèi)皮細胞增生為主要特征。膠質(zhì)瘤細胞的不斷生長、繁殖、浸潤，必須通過膠質(zhì)瘤間質(zhì)血管獲得營養(yǎng)物質(zhì)，間質(zhì)血管在維持腦膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)行為方面起著至關(guān)重要的作用。Morimoto等［2］利用內(nèi)皮抑素的單克隆抗體通過免疫印跡和免疫組織化學(xué)的方法對51例星形細胞瘤內(nèi)皮抑素的表達情況進行研究，發(fā)現(xiàn)Ⅳ級的星形細胞瘤組織中的內(nèi)皮抑素表達水平明顯高于低級別的瘤組織;內(nèi)皮抑素的免疫染色定位于所有級別的腫瘤血管上，在惡性腦膠質(zhì)瘤中內(nèi)皮抑素的陽性染色甚至廣泛包繞著靠近增生微血管周的瘤細胞。本研究結(jié)果與其基本一致，且研究還發(fā)現(xiàn)，隨著膠質(zhì)瘤病理級別的增高，其MVD值增加，并且組織中內(nèi)皮抑素的表達量也呈現(xiàn)增高趨勢。但是這一結(jié)果似乎與膠質(zhì)瘤高度血管化的臨床病理特征相矛盾。考慮原因可能為隨著腫瘤惡性程度的增高，其血管內(nèi)皮細胞高度增生，使得腫瘤組織中血管內(nèi)皮生成因子表達升高，從而促進腫瘤組織中多種膠原酶表達上調(diào)，而內(nèi)皮抑素是ⅩⅧ型膠原C端的一個水解片段，膠原酶表達增多可以促進內(nèi)皮抑素的生成增多。而Ratel等［5］認為惡性腫瘤組織以及血清中內(nèi)皮抑素抗體的存在可能使得腫瘤可以逃逸血管生成分子的作用，使得血管生成促進因子和抑制因子之間的平衡仍偏向血管生成有關(guān)。國內(nèi)學(xué)者［6］也認為其原因可能為機體內(nèi)部存在著某種平衡的機制，當(dāng)腫瘤組織中血管內(nèi)皮生成因子水平升高時，內(nèi)皮抑素的表達水平也隨之升高以期達到一種新的平衡狀態(tài)。但是由于兩者之間的表達上調(diào)速度不一致，血管內(nèi)皮生成因子水平上調(diào)快而內(nèi)皮抑素水平上調(diào)慢，導(dǎo)致在腫瘤組織中主要表現(xiàn)為促進新生血管生成，從而使得腫瘤快速生長。腫瘤組織中血管生成調(diào)控的復(fù)雜性可能也是某些腫瘤組織中內(nèi)皮抑素低表達的原因所在?？傊?，腫瘤組織中新生血管形成的調(diào)控機制以及與之相關(guān)的內(nèi)皮抑素蛋白的加工及滅活機制均有待進一步研究，抗血管生成療法也將有望成為徹底治愈腦膠質(zhì)瘤的有效手段之一。

1 Wong M L，Prawira A，Kaye A H et al.Tumour angiogenesis:its mechanism and therapeutic implications in malignant gliomas［J］.J Clin Neurosci，2009;16(9):1119-1130.

2 Morimoto T，Aoyagi M，Tamaki M et al.Increased levels of tissue endostatin in human malignant gliomas［J］.Clin Cancer Res，2002;8(9):2933-2988.

3 Strik H M，Schluesener H J，Seid K et al.Localization of endostatin in ratand human gliomas［J］.Cancer，2001;91(5):1013-1019.

4 Fujita Y，Abe R，Shimizu H.Clinical approaches toward tumor angiogenesis:past，present and future［J］.Curr Pharm，2008;14(36):3820-3834.

5 Ratel D，Nasser V，Dupre L et al.Antibodies to endostatin in a multifocal glioblastoma patient［J］.Lancet，2000;356(9242):1656-1657.

6 高文宏，陳謙學(xué)，劉 剛.內(nèi)皮抑素和血管內(nèi)皮生長因子在腦膠質(zhì)瘤中的表達及意義［J］.中國臨床神經(jīng)外科雜志，2006;11(2):86-87.