單肺通氣對大鼠肺組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制探討

黎 陽，易 娟，杜學(xué)柯，彭丹暉，陳肖東，黃 冰，潘靈輝，阮 林

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧530021)

單肺通氣(OLV)是胸科手術(shù)麻醉中常用的一種機(jī)械通氣模式。機(jī)械通氣能使炎癥級聯(lián)反應(yīng)激活，通過分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)效應(yīng)對肺組織產(chǎn)生損傷。有研究［1］認(rèn)為，在機(jī)械通氣早期就有肺泡上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生。2011年4～12月，我們觀察了OLV對大鼠肺組織細(xì)胞凋亡及凋亡執(zhí)行因子Caspase-3表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD雄性大鼠42只，體質(zhì)量200～250 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供;江灣Ⅰ型微型動物呼吸機(jī)，Caspase-3兔抗鼠單克隆抗體，GAPDH內(nèi)參抗體、TUNEL試劑盒、凝膠成像系統(tǒng)及配套分析軟件均購自美國Bio-Rad公司，多功能酶標(biāo)儀購自芬蘭雷勃公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將大鼠隨機(jī)分成OLV組(A組)18只、雙肺通氣組(B組)18只及對照組(C組)6只。根據(jù)通氣時(shí)間，A、B組又各分成3個亞組，即A1(OLV 0.5 h，恢復(fù)通氣0.5 h)、A2(OLV 1 h，恢復(fù)通氣 0.5 h)、A3 組(OLV 1.5 h，恢復(fù)通氣 0.5 h)及B1(雙肺通氣1 h)、B2(雙肺通氣1.5 h)、B3 組(雙肺通氣2 h)，各6只。

1.2.2 模型制備 A組大鼠肌注氯胺酮80 mg/kg、速眠新Ⅱ0.6～0.8 mL/kg麻醉，行氣管切開并插入氣管導(dǎo)管至主氣管;給予維庫溴銨2 mg/kg后接呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣，通氣參數(shù)為氧濃度(FiO2)100%、潮氣量(VT)10 mL/kg、呼吸頻率(RR)60次/min。于左側(cè)第5肋間開胸，暴露左肺;將氣管導(dǎo)管過深插入至右側(cè)支氣管，調(diào)節(jié)通氣參數(shù)VT 5～6 mL/kg、RR 80次/min;見左側(cè)肺葉萎陷，對側(cè)肺通氣，開始計(jì)時(shí);至各亞組預(yù)定時(shí)間后，將氣管導(dǎo)管退回主氣管開始復(fù)張，恢復(fù)至雙肺通氣時(shí)的通氣參數(shù)。B組則于暴露左肺后，始終保持雙肺通氣至預(yù)定時(shí)間。C組自主呼吸。

1.2.3 標(biāo)本采集 A、B組通氣至預(yù)定時(shí)間及C組麻醉后，立即頸動脈放血處死動物;分離兩側(cè)完整肺葉，置入預(yù)冷的生理鹽水中;漂洗數(shù)次以清潔表面的血跡，用濾紙吸干;取部分左肺下葉組織置入4%多聚甲醛固定48 h，脫水后石蠟包埋，做肺組織切片;將余下左肺下葉組織－80℃冰箱保存，備用。

1.2.4 檢測項(xiàng)目與方法 取左肺下葉組織行HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。Western blot法檢測100 mg超低溫保存肺組織中的Caspase-3蛋白，按試劑盒說明操作;用Image Lab凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片掃描后的反應(yīng)蛋白條帶圖像進(jìn)行分析，得出目標(biāo)條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示Caspase-3蛋白相對表達(dá)量。采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測肺組織的細(xì)胞凋亡，按試劑盒說明操作，細(xì)胞核呈棕黃色染色為陽性細(xì)胞;每張切片選取10個不重復(fù)視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，即每高倍視野中陽性細(xì)胞數(shù)和該高倍視野中細(xì)胞總數(shù)的比值，計(jì)算平均值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，各亞組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)，相對應(yīng)亞組間樣本比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織形態(tài)變化 C組肺組織無明顯病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，肺泡間隔正常。B組中B1組無明顯病理改變;隨通氣時(shí)間增加，B2、B3組肺泡內(nèi)可見少量滲出液，肺間質(zhì)增厚。A組中A1組可見少量滲出液，肺間質(zhì)增厚;A2、A3組非通氣側(cè)肺泡內(nèi)可見大量紅細(xì)胞，部分肺泡腔萎陷不張，肺間質(zhì)增厚明顯。

2.2 各組大鼠肺組織細(xì)胞AI及Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較 見表1。

表1 各組大鼠肺組織細(xì)胞AI及Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

表1 各組大鼠肺組織細(xì)胞AI及Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

注:與C組比較，*P＜0.05;與B組對應(yīng)亞組比較，#P＜0.05

組別 AI(%) Caspase-3蛋白A 組A1 0.13±0.08 0.22±0.02 A2 6.17±0.75*# 0.34±0.01*#A3 16.00±1.10*# 0.69±0.01*#B組B1 0.15±0.10 0.22±0.01 B2 0.18±0.08 0.23±0.01 B3 4.83±0.75* 0.28±0.01*C組0.12±0.08 0.21±0.02

3 討論

OLV期間，由于非通氣側(cè)肺的血液未得到充分氧合，造成靜脈血摻雜，引起肺組織缺氧，從而導(dǎo)致肺組織細(xì)胞損傷以及功能損害;此外，肺萎陷后復(fù)張及在復(fù)張通氣過程中過度的牽張等，可引起一系列反應(yīng)加重肺損傷［2，3］。本研究結(jié)果顯示，隨著 OLV時(shí)間延長，大鼠肺組織復(fù)張后出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞、充血水腫、肺間質(zhì)逐漸增厚等組織損傷并逐漸加重。說明OLV時(shí)非通氣側(cè)肺組織受到機(jī)械牽張時(shí)間雖然短，但此后的肺復(fù)張可加重萎陷肺組織的損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，C組肺組織中未見有凋亡細(xì)胞存在，B組只有在通氣2 h的肺泡腔內(nèi)側(cè)面及肺間質(zhì)中見少量凋亡細(xì)胞，而A組在機(jī)械通氣1.5 h時(shí)肺組織中就已經(jīng)出現(xiàn)凋亡細(xì)胞。在機(jī)械通氣2 h后，A組肺組織細(xì)胞的AI高于B組，提示A組肺組織中凋亡細(xì)胞的數(shù)量較B組多。在機(jī)械通氣過程中，支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞受到機(jī)械牽張的刺激，通過激活NF-κB的炎癥級聯(lián)反應(yīng)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［1］;多種因素通過誘導(dǎo)肺組織細(xì)胞過度凋亡導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)破壞，加重肺泡毛細(xì)血管膜的損傷從而參與急性肺損傷(ALI)的病理過程［4］。OLV較雙肺機(jī)械通氣易導(dǎo)致肺組織細(xì)胞凋亡，可能與肺組織的缺氧/低灌注、萎陷/復(fù)張有關(guān)。在OLV過程中，非通氣側(cè)肺萎陷，肺泡氧分壓下降，使得非通氣側(cè)肺組織缺氧;肺泡氧分壓下降可引起肺血管阻力增加即非通氣側(cè)肺缺氧性肺血管收縮(HPV)，是肺循環(huán)對缺氧的一種代償反應(yīng)，但是HPV在起到這些保護(hù)作用的同時(shí)，也減少了肺組織的血流灌注量。Krick等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在低氧的狀態(tài)下，大鼠可通過誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)引起肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡。肺組織缺氧或缺血/再灌注損傷時(shí)，組織中多形核白細(xì)胞(PMN)被激活，激活的PMN耗氧量大增，不但進(jìn)一步增加組織缺氧，而且還釋放大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，可導(dǎo)致及加重ALI［6］。有研究表明，小腸缺血再灌注后，可通過上調(diào)TNF-α導(dǎo)致Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡從而引起ALI。OLV各亞組的左肺雖然只通氣0.5 h，但隨著肺萎陷的時(shí)間延長，肺組織中細(xì)胞凋亡數(shù)量增加。游志堅(jiān)等［7］的研究也表明，兔OLV時(shí)肺組織氧化應(yīng)激水平顯著升高，且隨著OLV時(shí)間的延長表現(xiàn)更為明顯。在非通氣側(cè)肺萎陷后復(fù)張的過程中，肺泡的膨脹并非都是協(xié)調(diào)的，膨脹和萎陷肺泡交界處產(chǎn)生的界面切力對肺泡壁過度牽張可引起肺泡上皮細(xì)胞的凋亡［8］。以上的研究結(jié)果提示，OLV機(jī)械通氣時(shí)，肺萎陷可能較肺機(jī)械牽張更易導(dǎo)致肺細(xì)胞凋亡。肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的增加，可導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮屏障功能障礙［9，10］。隨著 OLV時(shí)間的延長，肺組織凋亡細(xì)胞增多，可導(dǎo)致肺泡和血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)破壞加重，這與本研究發(fā)現(xiàn)的隨著OLV時(shí)間延長，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)紅細(xì)胞、肺間質(zhì)水腫逐漸增厚等ALI病理改變相一致。

正常組織中的細(xì)胞凋亡對生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)的發(fā)育起著重要作用。Caspase家族屬于天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Caspase-3是其家族中最重要的一員，處于細(xì)胞凋亡的共同路徑上，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者之一。本研究中，C組的肺組織中出現(xiàn)凋亡細(xì)胞和Caspase-3蛋白表達(dá)可視為一種正常的生物學(xué)現(xiàn)象。Caspase-3在胞質(zhì)中以無活性的酶原形式存在，只有當(dāng)許多細(xì)胞外凋亡信號使之激活時(shí)，可引起細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞構(gòu)架的關(guān)鍵蛋白酶失活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，各組Caspase-3蛋白表達(dá)的變化與細(xì)胞凋亡變化的趨勢大體一致。

綜上所述，隨著通氣時(shí)間的延長，OLV可導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)的改變，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及Caspase-3蛋白表達(dá)增加。由此推測，細(xì)胞凋亡可能是OLV導(dǎo)致ALI的重要因素，該作用與Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。更具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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