忍貝顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

李樹鵬，劉鳳鳴，劉 永

忍貝顆粒由忍冬藤、浙貝母、魚腥草等組成，具有清熱解毒、宣肺化痰、益氣平喘的功效，用于治療急性支氣管炎及慢性支氣管炎急性發(fā)作期。忍冬藤為處方君藥，具有清熱解毒的功效［1］。為控制本品的質(zhì)量，本文對制劑中的忍冬藤、貝母、黃芩、魚腥草進(jìn)行了薄層色譜定性鑒別，采用高效液相色譜法測定了制劑中綠原酸的含量，為該制劑的質(zhì)量控制提供分析方法。

1 試藥與儀器

儀器:LC-10AT vp 型高效液相色譜儀(單元泵，SPD-10Avp 檢測器，N2000 化學(xué)工作站)。電子天平(上海天平儀器廠);KQ-300DE 型超聲提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)。試藥:綠原酸(含量測定用，批號:110753－200413)，購自中國藥品生物制品檢定所，甲醇為色譜純(Fisher Chemicals)，水為重蒸餾水，其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜法定性鑒別

2.1.1 忍冬藤的薄層鑒別［2］取本品5 g，加50 ml 水使溶解，加氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH 至7.0，加三氯甲烷洗2 次，每次20 ml，棄去三氯甲烷液，水溶液用水飽和正丁醇提取2 次，每次20 ml，合并正丁醇提取液加氨水洗2 次，每次30 ml，棄去氨試液，正丁醇提取液蒸干，殘渣加甲醇1 ml 使溶解，作為供試品溶液。取忍冬藤對照藥材2 g，加水50 ml，加熱回流1 h，過濾，放冷，同法制成對照藥材溶液。另取缺忍冬藤樣品5 g，同法制備，作為陰性對照液。吸取上述3 種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13:7:2)下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1.8 mol/L 硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。見圖1。

2.1.2 魚腥草的薄層鑒別［3］取本品5 g，加50 ml 水使溶解，用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH 至10.0，用乙酸乙酯60 ml 分2次提取，合并2 次乙酸乙酯提取液，蒸干至約1 ml，作為供試品溶液。另取魚腥草對照藥材2 g，加水50 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH 至10.0，同法制成對照藥材溶液。另取缺魚腥草樣品5 g，同法制備，作為陰性對照液。吸取上述3 種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(20:10:1:1)上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。見圖2。

2.1.3 黃芩的薄層鑒別［4］取本品5 g，研細(xì)，加乙酸乙酯-甲醇(3:1)的混合溶液30 ml，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 ml 溶解，作為供試品溶液。取缺黃芩樣品5 g，同法制備，作為陰性對照溶液。另取黃芩苷對照品加甲醇制成每1 ml 含1 mg 的溶液制成對照品溶液，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G 板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5:3:1:1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液。供試品色譜中，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。見圖3。

2.1.4 浙貝母的薄層鑒別［5］取本品5 g，研細(xì)，加氨水2 ml攪拌，加三氯甲烷40 ml，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷lml 使溶解，作為供試品溶液;另取浙貝母對照藥材粉末2 g，同法制成對照藥材溶液;取缺浙貝母樣品5 g，同法制備，作為陰性對照液。照薄層色譜法(2005 版藥典附錄VIB)試驗，吸取上述3 種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G 板上，以乙酸乙酯-甲醇-氨水(17:2:1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾。見圖4。

圖1

圖2

圖3

圖4

2.2 綠原酸含量測定［6-7］

2.2.1 溶液的制備 供試品溶液的制備:精密量取本品2 g，置25 ml 量瓶中，加50%甲醇至刻度，超聲處理(功率250 W，頻率30 kHz)30min，放冷，搖勻，以0.45 μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。(1)陰性對照溶液的制備:按處方比例并參照本品制備工藝，配制不含忍冬藤的陰性樣品，同法處理，制備成陰性供試品溶液，備用。(2)對照品溶液的制備:精密稱取綠原酸對照品適量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 ml中含綠原酸40 μg 的溶液，即得。

2.2.2 色譜條件 依利特色譜柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇-水-冰醋酸(28:72:0.5)為流動相;流速為1.0 ml/min;進(jìn)樣量為10 μl;理論板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于3 000。綠原酸對照品溶液、供試品溶液、缺忍冬藤陰性對照溶液的高效液相色譜圖(見圖5)。陰性對照品溶液在與對照品溶液相同保留時間位置上無吸收峰。

2.2.3 線性關(guān)系考察 依據(jù)“2.2.2”項下色譜條件，以自動進(jìn)樣器精密吸取濃度為0.04 mg/ml 的綠原酸對照品溶液4 μl、8 μl、12 μl、16 μl、20 μl，依次注入高效液相色譜儀，測定綠原酸色譜峰面積，以綠原酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為A =5 ×106C－5024.5，相關(guān)系數(shù)r=0.9997。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，天麻素進(jìn)樣量在0.16～0.80 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度實驗 精密吸取濃度為0.04 mg/ml 的綠原酸對照品溶液10 μl，注入高效液相色譜儀，測定，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積。RSD = 0.2% ，結(jié)果表明儀器精密度良好。2.2.5 穩(wěn)定性實驗 吸取“2.2.1”項下制備的供試品液，按上述色譜條件，每隔4h 測定1 次綠原酸色譜峰面積，考察供試品液在24 h 內(nèi)的穩(wěn)定性，結(jié)果分別為214 284，221 794，213 450，216 555，213 988，210 695.RSD=1.75%(n=6)，結(jié)果表明，供試品液的綠原酸色譜峰面積在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6 重現(xiàn)性實驗 取本品(批號090220)研細(xì)，取約2 g，平行5 份，精密稱定，按照“2.2.1 ”項下方法制得供試品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件，精密吸取10 μl 注入高效液相色譜儀，測定綠原酸的含量，測得本品每克含綠原酸分別為0.467，0.486，0.482，0.486，0.485 mg，即綠原酸平均含量為0.481 mg/g，RSD=1.68%(n=5)。結(jié)果表明，該實驗操作重現(xiàn)性好，符合要求。

2.2.7 回收率實驗 采用加樣回收法。取已測知綠原酸含量的樣品(批號090220)研細(xì)，綠原酸含量為0.486 mg/g，取約0.5 g，平行6 份，精密稱定，分別精密加入濃度為0.8 mg/ml 的綠原酸對照品溶液3 ml，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件測定，求得平均回收率為99.6% ，RSD =0.96% ，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，該實驗方法測定綠原酸含量準(zhǔn)確度合格。

2.2.8 樣品測定 連續(xù)6 批樣品按上述方法制備樣品溶液，分別精密量取樣品溶液和對照品溶液各10 μl 注入液相色譜儀，按外標(biāo)法以峰面積計算含量，結(jié)果見表2。

圖5 高效液相色譜圖

表1 綠原酸回收率試驗結(jié)果

表2 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

忍冬藤為常用中藥，具有清熱解毒，疏風(fēng)通絡(luò)的功效。綠原酸為忍冬藤藥材的主要有效成分，所以我們對綠原酸進(jìn)行了薄層鑒別和含量測定。在綠原酸供試品溶液的制備中，先后考察了不同的提取溶劑(甲醇、75%甲醇和50%甲醇)、不同提取方法(超聲、加熱回流)、不同的超聲時間(15 min，30 min，45 min)對綠原酸含量測定的影響，最后選定供試液制備方法為50%甲醇加熱超聲提取30 min。在選擇流動相時，筆者也曾采用過甲醇－水(28:72)、甲醇－水(40:60)、甲醇－水－冰醋酸(28:72:0.5)，結(jié)果以甲醇-水-冰醋酸(28:72:0.5)分離效果較理想，可使制劑中綠原酸達(dá)到基線分離。本法能夠較好地控制忍貝顆粒中綠原酸的含量，可作為控制該產(chǎn)品質(zhì)量的指標(biāo)。

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