一測(cè)多評(píng)法用于忍冬藤多成分含量測(cè)定的適用性研究

田偉 甄亞欽 王鑫國(guó) 田宇柔 李軍山 牛麗穎

摘要：目的 建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定忍冬藤中綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷6種成分含量的方法，并驗(yàn)證該法在忍冬藤質(zhì)量控制中應(yīng)用的可行性與適用性。方法 以綠原酸為內(nèi)參物，采用Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸，梯度洗脫，流速為1 mL/min，綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，馬錢苷檢測(cè)波長(zhǎng)為236 nm，柱溫35 ℃。結(jié)果 建立了忍冬藤中綠原酸與咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的相對(duì)校正因子；一測(cè)多評(píng)法的計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值無明顯差異。結(jié)論 一測(cè)多評(píng)的質(zhì)量控制模式可用于忍冬藤中6種不同成分的多指標(biāo)同步質(zhì)量評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞：一測(cè)多評(píng)；相對(duì)校正因子；綠原酸；忍冬藤；質(zhì)量評(píng)價(jià)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.017

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）11-0077-06

Abstract： Objective To establish a QAMS method for content determination of six compositions （chlorogenic acid， caffeic acid， cryptochlorogenin acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C and loganin） from Lonicerae Japonicae Caulis； To verify the feasibility and applicability of this method in quality control of Lonicerae Japonicae Caulis. Methods Chlorogenic acid was set as internal reference substance. The HPLC analysis was performed on a Waters Symmetry C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） with a mobile phase consisted of acetonitrile and 0.4% phosphoric acid solution in gradient elution manner at a flow rate of 1 mL/min. The column temperature was maintained at 35 ℃， and the detection wavelength was set at 327 nm for chlorogenic acid， caffeic acid， cryptochlorogenin acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C and 236 nm for loganin. Results The relative correction factors of caffeic acid， cryptochlorogenin acid， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C and loganin were established； there was no obvious difference between calculated value of QAMS and measured value of external standard method. Conclusion The quality control mode of QAMS can be used for multi-index synchronization quality evaluation of the six compositions from Lonicerae Japonicae Caulis.

Keywords： QAMS； relative correction factors； chlorogenic acid； Lonicerae Japonicae Caulis； quality evaluation

忍冬藤為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥莖枝，具有清熱解毒、疏風(fēng)通絡(luò)功效，用于溫病發(fā)熱、熱毒血痢、癰腫瘡瘍、風(fēng)濕熱痹、關(guān)節(jié)紅腫熱痛[1]。忍冬是我國(guó)傳統(tǒng)藥用植物，具有抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等多種藥理作用[2]?！侗静菥V目》云：“忍冬，莖葉同花，功用皆同。”金銀花是忍冬的干燥花蕾或帶初開的花，在中藥制劑、茶飲、保健品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，因需求量大，出現(xiàn)供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。忍冬藤資源豐富、價(jià)格便宜，具有良好的開發(fā)前景。

忍冬藤含有有機(jī)酸、環(huán)烯醚萜苷、黃酮等多類成分[3-4]，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》僅將馬錢苷和綠原酸作為忍冬藤的含量測(cè)定指標(biāo)成分，不能完全反映該藥材的真實(shí)品質(zhì)。一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）是利用中藥中有效成分函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，通過測(cè)定1個(gè)有效成分（性質(zhì)穩(wěn)定且易得到的對(duì)照品）實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分（性質(zhì)不穩(wěn)定且難得到的對(duì)照品）的同時(shí)測(cè)定，該方法快速、簡(jiǎn)便，是一種符合中藥多成分特點(diǎn)的多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，已廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制中[5]。為了對(duì)忍冬藤進(jìn)行多指標(biāo)控制，本研究以綠原酸為內(nèi)參物，對(duì)咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷QAMS同步測(cè)定的可行性與適用性進(jìn)行探討與評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀，包括LC-15C泵、SPD-15C型紫外檢測(cè)器、SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-15C柱溫箱、島津LC色譜工作站；美國(guó)賽默飛公司Ultimate 3000高效液相色譜儀，包括低壓三元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器、變色龍色譜工作站；沃特世e2695高效液相色譜儀，包括低壓四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、2489紫外檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站；色譜柱為Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Wondasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；電子天平（TB-215D，德國(guó)賽多利斯）；KQ-250E超聲波清洗器（昆山市超聲儀有限公司）。

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)PY20170216，純度99.96%）、隱綠原酸對(duì)照品（批號(hào)PY20170224，純度99.79%）、異綠原酸C對(duì)照品（批號(hào)PY20170303，純度91.88%）、馬錢苷對(duì)照品（批號(hào)PY20170108，純度99.31%），南京普怡生物科技有限公司；咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)110885-200102，純度100.00%）、異綠原酸A對(duì)照品（批號(hào)111782-201405，純度92.00%），中國(guó)食品藥品檢定研究院，乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

20批忍冬藤樣品中15批由神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，另5批分別購(gòu)自石家莊樂仁堂、新興藥房、德濟(jì)堂、梔子藥房、百醫(yī)堂，經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院孫寶惠主任中藥師鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥莖枝，編號(hào)為1～20。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法的建立和驗(yàn)證

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.4%磷酸（B），梯度洗脫（0～30 min，7%A；30～32 min，7%～10%A；32～44 min，10%A；44～50 min，10%～21%A；50～60 min，21%～34%A；60～65 min，34%A）；流速1 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C為327 nm，馬錢苷為236 nm；進(jìn)樣量10 ?L。色譜圖見圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成濃度分別為0.097 9、0.020 6、0.007 5、0.054 4、0.021 3、0.169 8 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取忍冬藤粉末（過3號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、4、6、10、15、20 ?L注入液相色譜儀，測(cè)定綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷6種成分在相應(yīng)范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.4.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 ?L，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的峰面積RSD分別為0.23%、0.28%、0.42%、0.23%、0.10%、0.18%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、10、16 h進(jìn)樣10 ?L，測(cè)得綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的峰面積RSD分別為1.85%、1.68%、1.57%、1.91%、1.66%、1.08%，表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)忍冬藤樣品6份，每份約1 g，精密稱定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測(cè)定綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的峰面積，計(jì)算含量的RSD分別為1.56%、1.08%、1.27%、1.46%、1.17%、0.83%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.4.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品粉末9份，每份約0.5 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，分別按各成分含量的80%、100%、120%精密加入綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的對(duì)照品貯備液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率及RSD，結(jié)果見表2～表7。表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2 相對(duì)校正因子的確定

2.2.1 相對(duì)校正因子的計(jì)算

取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2、6、10、16、20 ?L，計(jì)算各相對(duì)校正因子。fk/m=fk/fm=Wk×Am/（Wm×Ak），式中，Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量，Am為組分m的峰面積，Wm為組分m的質(zhì)量。以綠原酸為內(nèi)標(biāo)物，分別計(jì)算咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷的相對(duì)校正因子，結(jié)果見表8。

2.2.2 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察

按相對(duì)校正因子測(cè)定條件和方法，分別采用3種不同的色譜儀和3種色譜柱測(cè)定，并計(jì)算綠原酸對(duì)咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷的fk/m，計(jì)算平均值，結(jié)果見表9。

2.2.3 待測(cè)色譜峰定位

采用不同色譜儀及色譜柱，待測(cè)組分的保留時(shí)間會(huì)有所波動(dòng)，在色譜峰定位中一般采用相對(duì)保留時(shí)間或保留時(shí)間差法[6-8]。取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別采用3種不同色譜儀和3種色譜柱測(cè)定，并計(jì)算綠原酸對(duì)咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷的相對(duì)保留時(shí)間（rk/m），結(jié)果見表10，RSD均小于5%，表明利用相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行色譜峰的定位是可行的。

2.2.4 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

首先采用外標(biāo)法（extermal standard method，ESM）對(duì)忍冬藤中綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷進(jìn)行多成分同步定量測(cè)定，再用建立的QAMS方法計(jì)算咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C和馬錢苷的質(zhì)量。Wm=Wk×Am/（fk/m×Ak），式中，Ak為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)樣量（質(zhì)量），Am為組分m峰面積，Wm為組分m的質(zhì)量。

每批樣品分別用2種方法平行測(cè)定2次，將2種方法的結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證QAMS用于忍冬藤中不同成分含量測(cè)定的可靠性，結(jié)果見表11。2種方法測(cè)得的忍冬藤中各成分含量無明顯差異，RSD均小于5%，提示建立的方法具有較好的可信度。

3 討論

本試驗(yàn)采用雙波長(zhǎng)模式同時(shí)測(cè)定忍冬藤中6種化學(xué)成分，其中，綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C的檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm，馬錢苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為236 nm。馬錢苷在327 nm波長(zhǎng)處無吸收，綠原酸等有機(jī)酸雖然在236 nm波長(zhǎng)處有吸收，但分離易受忍冬藤中其他環(huán)烯醚萜苷類成分的影響，因此，采用雙波長(zhǎng)模式同時(shí)測(cè)定，可以克服單一波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)信息量不足的缺點(diǎn)，使每個(gè)待測(cè)成分色譜峰均可以最大峰面積覆蓋圖譜。目前，QAMS方法多采用單一波長(zhǎng)測(cè)定中藥中同一類成分的含量[9-10]。本研究結(jié)果表明，QAMS方法同樣適用于雙波長(zhǎng)模式和多類成分的同時(shí)測(cè)定。

綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷在忍冬藤中含量較大，生物活性較高，因此將此6種成分作為忍冬藤質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)。其中，綠原酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且廉價(jià)易得，作為內(nèi)標(biāo)物，建立其與咖啡酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、馬錢苷的相對(duì)校正因子，在不同液相色譜系統(tǒng)與色譜柱中RSD均小于5%，符合測(cè)定要求。故選擇綠原酸為內(nèi)標(biāo)物，以降低檢測(cè)成本。

本試驗(yàn)采用3套液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行色譜峰定位的重現(xiàn)性考察。雖然在不同色譜儀和不同色譜柱中相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于5%，但在同一色譜儀中色譜峰定位更為準(zhǔn)確。在島津HPLC儀中，3種色譜柱綠原酸與異綠原酸C相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.66%，在賽默飛HPLC儀中，3種色譜柱綠原酸與異綠原酸C相對(duì)保留時(shí)間的RSD為1.36%；在沃特世HPLC儀中，3種色譜柱綠原酸與異綠原酸C相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.66%。而賽默飛HPLC儀與沃特世HPLC儀計(jì)算的RSD為1.94%，3臺(tái)HPLC儀計(jì)算的RSD則達(dá)到3.25%。這與3套液相色譜系統(tǒng)流動(dòng)相的混合方式不同有關(guān)，島津液相色譜系統(tǒng)是二元高壓梯度，賽默飛和沃特世液相色譜系統(tǒng)是低壓梯度，流動(dòng)相混合的位置與精度有一定差異，梯度變化時(shí)的時(shí)間延遲也不相同，從而導(dǎo)致色譜峰定位上的差別。因此，在建立QAMS方法時(shí)應(yīng)注意此問題。

本試驗(yàn)以忍冬藤為研究對(duì)象，通過方法學(xué)確證、相對(duì)校正因子的確認(rèn)與重現(xiàn)性考察、色譜峰的定位和QAMS準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)，對(duì)QAMS技術(shù)在忍冬藤中的適應(yīng)性和應(yīng)用可行性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，采用QAMS測(cè)得的各成分含量與ESM測(cè)定結(jié)果沒有明顯差異，具有較高的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及可信度。此方法的建立為全面考察忍冬藤質(zhì)量提供了參考方法，提示在缺少對(duì)照品的情況下，通過相對(duì)校正因子及色譜峰的定位計(jì)算含量，可以實(shí)現(xiàn)忍冬藤中6種成分的質(zhì)量控制。該方法作為忍冬藤質(zhì)量的一種有效評(píng)價(jià)方式，可為忍冬藤的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考和依據(jù)。

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