康艾注射液和苦參素注射液對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

黃素培(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，河南新鄉(xiāng) 453002)

康艾注射液為我國獨(dú)立研制的新一代抗惡性腫瘤中成藥，由人參、黃芪、苦參素三味中藥組方制成，對(duì)原發(fā)性肝癌、直腸癌和婦科腫瘤等有較好療效。康艾注射液的主要成分為氧化苦參堿(oxymatrin，OMT)，又稱“苦參素”，是我國草藥中有效成分被純化的“三素”(另有黃連素、青蒿素)之一。近年來，對(duì)其抗腫瘤作用的基礎(chǔ)研究充分顯示OMT和其活性代謝物苦參堿(matrine，MT)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和表達(dá)［1-5］，可能與含OMT的復(fù)方康艾注射液的抗腫瘤作用有關(guān)。但康艾注射液抗腫瘤作用的主要成分及作用機(jī)制目前尚不明確，且無研究報(bào)道。因此為更深入探討康艾注射液抗腫瘤作用的主要成分及作用機(jī)制，我們對(duì)康艾注射液和其主要有效成分苦參素對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用進(jìn)行了對(duì)比研究，為揭示康艾注射液的科學(xué)內(nèi)涵提供一定的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HERA細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國heraeus公司產(chǎn)品，HERA Cell型);臺(tái)式離心機(jī)(德國Heraes公司，Biofuge Stratos型);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(奧地利Tecan公司產(chǎn)品，GeNios DNA Expert型);蒸汽消毒器(山東安得醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品，YXQG02型); Milli-Q超純水制造系統(tǒng)(德國 Millipore公司產(chǎn)品，Milli-Q.SYNTHESIS型);OLYMPUS倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品，PM-10AD型);醫(yī)用凈化工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品，SWJ-1F型)。

1.2 材料

HO-8910細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所;HyQ改良型RPMI 1640培養(yǎng)基(?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司提供);胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司提供);胰酶(美國Amersco公司生產(chǎn));注射用青霉素鈉(山東濰坊制藥廠生產(chǎn));硫酸鏈霉素(大連美羅大藥廠生產(chǎn));康艾注射液(長白山制藥股份有限公司生產(chǎn));苦參素注射液(200 mg，山東方明藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn));二甲基亞砜(DMSO，天津瑞金特化學(xué)品有限公司提供);氯丁膠新型交聯(lián)劑(MTT，Sigma公司提供);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，NY 1483)。

2 方法

2.1 細(xì)胞株的復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)

將裝有人胃癌SGC-7901細(xì)胞的凍存管從液氮罐中取出，快速放入37℃恒溫水鍋中解凍。待完全解凍后，用吸管吸取含細(xì)胞的凍存液置無菌離心管，放入離心機(jī)1 500 rpm離心5 min，棄上清液。加入磷酸鹽緩沖液(PBS)液洗滌，1 500 rpm離心5 min，棄上清液，重復(fù)2次。向凍存管中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打細(xì)胞。將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶，加入適量含10%胎牛血清和1%雙抗的培養(yǎng)液。將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱37℃，5%CO2培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞貼壁情況，酌情換液。培養(yǎng)2～3 d后對(duì)生長良好HO-8910細(xì)胞，按貼壁細(xì)胞傳代要求用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液分瓶傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。人大腸癌細(xì)胞株HCT-8、人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910的復(fù)蘇與上述人胃癌SGC-7901細(xì)胞的復(fù)蘇方法類似。人白血病細(xì)胞株K-562按照懸浮細(xì)胞的復(fù)蘇及傳代要求復(fù)蘇后制成單細(xì)胞懸液分瓶傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 不同瘤株藥敏試驗(yàn)

取含5×104個(gè)/mL的HO-8910細(xì)胞懸液100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，分別加入苦參素注射液，使其終濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 g·L－1，加RPMI 1640培養(yǎng)液至200 μL，另設(shè)空白孔(只加培養(yǎng)液200 μL)和對(duì)照孔(只加細(xì)胞懸液200 μL)，每濃度均作6個(gè)平行孔，5% CO2培養(yǎng)箱孵育72 h后，加入20 μL MTT(5 mg·mL－1)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，棄上清，每孔加入DMSO 200 μL，放入酶標(biāo)儀，中速振蕩5 min后，于570 nm波長處測(cè)定吸光度A值，每個(gè)濃度平行測(cè)定6孔。按下列公式求出生長抑制率(inhibition ratio，IR)。抑制率IR(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組平均A值/空白對(duì)照平均A值)×100%。

按上述方法測(cè)定苦參素對(duì)人大腸癌HCT-8細(xì)胞、人胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制率，用IC50計(jì)算軟件計(jì)算IC50。K-562細(xì)胞按上述方法處理至加 MTT溫孵4 h后，1 500 rpm離心5 min，吸棄上清，再按上述步驟加入DMSO溶解后測(cè)其光密度值，計(jì)算抑瘤率及IC50。

2.3 單方和復(fù)方的抑瘤活性比較

取含5×104個(gè)/mL的HO-8910細(xì)胞懸液100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，分別加入康艾注射液(按OMT的含量算)和苦參素注射液，使其終濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 g·L－1，加RPMI 1640培養(yǎng)液至200 μL，另設(shè)空白孔(只加培養(yǎng)液200 μL)和對(duì)照孔(只加細(xì)胞懸液200 μL)，每濃度均作6個(gè)平行孔，5%CO2培養(yǎng)箱孵育72 h后，加入20 μL MTT(5 mg·mL－1)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，棄上清，每孔加入DMSO 200 μL，放入酶標(biāo)儀，中速振蕩5 min后，于570 nm波長處測(cè)定吸光度A值，每個(gè)濃度平行測(cè)定6孔。按公式計(jì)算出IR。

2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用較強(qiáng)的濃度，分別加入半數(shù)抑制濃度的劑量，作用48 h，倒置顯微鏡下觀察，攝片。同時(shí)用無藥的培養(yǎng)液處理設(shè)對(duì)照。

3 結(jié)果

3.1 藥物濃度和抑瘤效應(yīng)

苦參素注射液和康艾注射液對(duì)HCT-8、K-562、HO-8910、SGC-7901的抑瘤率均隨濃度的增高而增強(qiáng)，見表1。Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，苦參素和康艾注射液的濃度與其對(duì)HCT-8、K-562、HO-8910、SGC-7901抑瘤率均呈正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)r分別為:0.935、0.933、0.942、0.952和0.947、0.915、0.953、0.964。

3.2 不同瘤株藥敏性差異

苦參素注射液和康艾注射液對(duì)HCT-8、K-562、HO-8910、SGC-7901的 IC50分別為:1012.03、719.28、681.64、1 034.15 mg·L－1和905.99、764.10、686.27、995.52 mg·L－1，不同腫瘤細(xì)胞對(duì)同一藥物的敏感性存在較大差異，苦參素和康艾對(duì)HO-8910細(xì)胞相對(duì)較為敏感。

表1 苦參素注射液和康艾注射液對(duì)不同瘤株的抑制率(%)Tab 1 Inhibitory effects of Kushenin and Kangai injection on different tumor cells(inhibition ratio，%)

3.3 單方和復(fù)方抑瘤活性比較

配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，相同濃度的苦參素注射液和康艾注射液體外對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用無顯著性差異(P＞0.05)，結(jié)果提示氧化苦參堿即苦參素可能為復(fù)方康艾注射液中直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖的主要有效成分。

3.4 給藥后細(xì)胞的形態(tài)差異

接種24 h后，在普通倒置相差顯微鏡下觀察到HCT-8、HO-8910、SGC-7901細(xì)胞基本都貼壁，K-562細(xì)胞飽滿，邊沿清晰。換液、加苦參素后逐日觀察，發(fā)現(xiàn)苦參素作用下的HCT-8、HO-8910、SGC-7910細(xì)胞均逐漸變圓，體積變小，折光性減弱，細(xì)胞變粗糙，貼壁細(xì)胞減少，細(xì)胞形態(tài)為三角形、多邊形和圓形，出現(xiàn)懸浮細(xì)胞，而且作用時(shí)間越長，現(xiàn)象越明顯。當(dāng)藥物作用2 d后，苦參素作用組的細(xì)胞多數(shù)脫落，懸浮于培養(yǎng)液中，有少數(shù)細(xì)胞體積增大，細(xì)胞破裂，呈細(xì)胞壞死狀。對(duì)照組細(xì)胞生長正常，細(xì)胞邊緣清晰，貼壁細(xì)胞幾乎無懸浮細(xì)胞，K-562細(xì)胞飽滿，邊沿清晰，形態(tài)正常，見圖1～4。

圖1 對(duì)照組與K-562細(xì)胞藥物處理組細(xì)胞形態(tài)學(xué)Fig 1 Cell morphology of control and drug treated K-562cellsA對(duì)照組;B藥物處理組A control cells;B drug treated cells

圖2 對(duì)照組與HCT-8細(xì)胞藥物處理組細(xì)胞形態(tài)學(xué)Fig 2 Cell morphology of control and drug treated HCT-8 cellsA對(duì)照組;B藥物處理組A control cells;B drug treated cells

圖3 對(duì)照組與SGC-7901細(xì)胞藥物處理組細(xì)胞形態(tài)學(xué)Fig 3 Cell morphology of control and drug treated SGC-7901 cellA對(duì)照組;B藥物處理組A control cells;B drug treated cells

圖4 對(duì)照組與HO-8910細(xì)胞藥物處理組細(xì)胞形態(tài)學(xué)Fig 4 Cell morphology of control and drug treated HO-8910 cellA對(duì)照組;B藥物處理組A control cells;B drug treated cells

4 討論

4.1 實(shí)驗(yàn)方法

MTT法是在1983年，由Mosmann首先建立的，因其快速、簡便、重復(fù)性好、可半自動(dòng)操作，逐年來在國內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究中被廣泛采用，主要用于一些生物活性檢測(cè)、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)及腫瘤放射敏感性測(cè)定等［6］。MTT法在檢測(cè)抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用時(shí)具有靈敏性高、結(jié)果重復(fù)性好、操作簡便、經(jīng)濟(jì)、快速、可批量檢測(cè)樣品等特點(diǎn)，因此，在本課題中我們選擇MTT法來檢測(cè)目標(biāo)藥物對(duì)細(xì)胞生長、增殖的抑制作用。研究表明，MTT甲臜產(chǎn)物的吸收光譜在DMSO溶液中有兩個(gè)峰，低峰為420 nm，高峰為560 nm左右，同時(shí)也有許多研究報(bào)告表明［7］，MTT與細(xì)胞在37℃孵育4h后形成的MTT甲臜產(chǎn)物的最大吸收波長為570 nm，本實(shí)驗(yàn)顯示MTT與實(shí)驗(yàn)所用腫瘤細(xì)胞在37℃孵育4 h后形成的MTT甲臜產(chǎn)物的最大吸收波長約為570 nm，因而本實(shí)驗(yàn)采用的酶標(biāo)儀濾光片波長為570 nm。

4.2 藥敏試驗(yàn)用瘤株

資料顯示［8］，不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性存在很大的差異，這種差異直接影響試驗(yàn)的結(jié)果，所以選擇敏感瘤株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)顯得至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)資料分別選用HO-8910、K-562、Hct-8、SCG-7901細(xì)胞進(jìn)行了試驗(yàn)用瘤株篩選試驗(yàn)，結(jié)果顯示不同的腫瘤細(xì)胞株對(duì)同一藥物的敏感性不同，特定的藥物試驗(yàn)中選擇敏感瘤株顯得至關(guān)重。

4.3 單方和復(fù)方

根據(jù)中藥配伍理論，由于藥物性質(zhì)各有不同，配合后可發(fā)生各種變化，有的可以加強(qiáng)療效，有的可以降低療效。這就是中醫(yī)中的“相惡”、“相殺”、“相須”、“相使”理論。康艾注射液為新一代純中藥注射液，除苦參素外，還含有從黃芪及人參中提取出的多種化學(xué)成分，其各成分在該復(fù)方中的發(fā)揮抗腫瘤作用效應(yīng)機(jī)制及途徑尚不明確，但根據(jù)中醫(yī)理論，苦參素為該復(fù)方中的“君藥”，可能為其直接抑瘤的主要成分。為此，我們對(duì)康艾注射液和苦參素注射液對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，康艾注射液和苦參素注射液體外的抑瘤作用無顯著性差別，由此我們推測(cè)苦參素可能為康艾注射液在體外發(fā)揮直接抑瘤作用的主要物質(zhì)。復(fù)方中的其他成分可能通過不同的途徑和機(jī)制增強(qiáng)其抗腫瘤作用。

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