凡納濱對蝦酶解產(chǎn)物過敏原消減效果的評價

王麗娟，胡志和，馬霖，胡金民

（1.天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津300134；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院制藥系，天津300134）

隨著一個個涉及食品安全的事件的發(fā)生，食品安全問題已日益受到人們的關(guān)注，食物過敏是涉及食品安全的一個重要問題。蝦以其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，頗受人們的喜愛，成為人類重要的食物性蛋白質(zhì)來源之一。然而，蝦與蟹等甲殼類動物及其制品又是引起食物過敏較常見的一類食品[1]。因此，研究蝦過敏及蝦過敏原，探索消減蝦過敏原的工藝技術(shù)，進一步為開發(fā)低敏及脫敏的蝦類食品奠定基礎(chǔ)。該項研究通過觀察并比較凡納濱對蝦木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的全身性過敏反應(yīng)及其對豚鼠回腸平滑肌的致敏作用，以評價和比較木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物過敏原的消減效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

1.1.1.1 動物

英國種Hartly 豚鼠，體重170 g～250 g，雌雄各半：由天津市實驗動物中心提供，合格證號為SCXK 津2005-0001。

1.1.1.2 主要試劑及藥品

凡納濱對蝦：購于天津市老板娘水產(chǎn)城，為活品；蝦蛋白、蝦肉及木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物：由本校食品生物技術(shù)重點實驗室制備，根據(jù)實驗要求配制成不同濃度的溶液；卵白蛋白：美國Sigma 公司，II 型，有效期2012年9月；木瓜蛋白酶：Papain，Sigma 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗人IgE 抗體：A9667，Sigma 公司，等。

1.1.2 主要儀器

BL-420F 生物信號采集系統(tǒng)：成都泰盟科技有限公司；張力傳感器：成都泰盟科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 凡納濱對蝦蝦肉蛋白粉的制備

將凡納濱對蝦去殼、去頭、去尾、去腸線后放在勻漿器中勻漿，冷凍干燥，儲藏于-20 ℃的冰箱中備用。

1.2.2 凡納濱對蝦蛋白質(zhì)的制備

將凡納濱對蝦去殼、去頭、去尾、去腸線后放在勻漿器中勻漿，然后加入4 倍體積的冷丙酮（-20 ℃預(yù)冷過夜），8 000 r/min 離心15 min，收集沉淀物并轉(zhuǎn)移至干凈的濾紙上，分散并讓其在室溫下空氣中風(fēng)干后粉碎，之后用抽提液[1 mol/L KCl and 0.5 mmol/L DTT（1，4-Dithiothreitol），pH7.4]按1：10（體積比）的比例抽提過夜，8 000 r/min，離心15 min，取上清。沉淀用抽提液繼續(xù)抽提4 h，離心取上清。透析過夜，合并2 上清液后冷凍干燥，儲藏于-20 ℃的冰箱中備用[2]。蝦肉蛋白粉提取蝦蛋白的比率為20%。

1.2.3 凡納濱對蝦蝦肉木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的制備

將凡納濱對蝦蝦肉用木瓜蛋白酶進行分解，其酶解條件為酶與底物1：100（g/g），水解溫度為60 ℃，底物濃度為5%（g/mL），水解時間為3 h。在酶解過程中，注意控制酶解液pH（6.5）。酶解結(jié)束后，將酶解液pH調(diào)至中性，用80 ℃滅酶10 min，冷凍干燥備用。

本實驗中對水解后的凡納濱對蝦蝦肉在4 ℃下8 000 r/m 離心15 min 處理后，將上清凍干后進行酶聯(lián)免疫檢測，檢測時用未水解的蝦蛋白抽提物作為陽性對照，用正常人血清為一抗作陰性對照。本酶解產(chǎn)物經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測其光密度（OD 值）為0.049。

1.2.4 全身過敏反應(yīng)

將合格豚鼠隨機分組，每組6 只，雌雄各半。在實驗室適應(yīng)1 周后進行初次致敏，激發(fā)時靜脈注射不成功者舍棄，由于灌胃出現(xiàn)意外者舍棄，保證每組5 只以上。各組的致敏與激發(fā)方法見表1。致敏期間每天2 次觀察豚鼠的反應(yīng)，包括一般狀態(tài)、進食、有無過敏反應(yīng)等。激發(fā)后立即觀察60 min 內(nèi)動物的反應(yīng)，觀察指標(biāo)及過敏反應(yīng)評定標(biāo)準(zhǔn)[3]如表2。

1.2.5 致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏性收縮試驗

將合格豚鼠隨機分組，每組5 只，雌雄兼用。豚鼠在實驗室適應(yīng)1 周后，各組先用卵白蛋白等物質(zhì)進行致敏。致敏時行腹腔注射或灌胃，每次每只豚鼠給予1.0 mL，隔日1 次，共3 次。末次注射后第14 天進行離體腸平滑肌過敏原攻擊試驗，取致敏豚鼠，放血處死，取出回腸一段，按離體器官裝置進行描記，浴管內(nèi)均加入30 mL 臺氏液。待腸收縮曲線基線穩(wěn)定后，進行過敏抗原攻擊，觀察、記錄腸收縮幅度，并比較各組腸收縮變化率[4]。

表1 全身過敏反應(yīng)致敏與激發(fā)方法Table 1 Sensitization and Stimulation methods of generalized anaphylaxis

表2 豚鼠過敏反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standard of generalized anaphylaxis in guinea pig

腸收縮變化率=[（攻擊后的腸平滑肌收縮力-攻擊前的腸平滑肌收縮力）/攻擊前的腸平滑肌收縮力]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 全身過敏反應(yīng)

按照表1 的分組和表2 的評判指標(biāo)和評分標(biāo)準(zhǔn)，用卵白蛋白、凡納濱對蝦蛋白、蝦肉及蝦蛋白和蝦肉的木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物對各組豚鼠分別進行致敏和激發(fā)，激發(fā)后密切觀察、記錄，并進行評分。各組動物全身過敏反應(yīng)的結(jié)果見表3。

表3 中，1 組至5 組為腹腔注射致敏，靜脈注射激發(fā)過敏反應(yīng)。由表3 中的結(jié)果可以看出，凡納濱對蝦蛋白致敏并激發(fā)組（2 組）存在有明顯的過敏反應(yīng)，表現(xiàn)為Ⅰ型速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，全部出現(xiàn)過敏性休克死亡，反應(yīng)與陽性對照品卵白蛋白（1 組）極其相似；凡納濱對蝦蝦肉組（4 組）的過敏反應(yīng)與蝦蛋白及卵白蛋白組也極其相似。而蝦蛋白和蝦肉木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物組（3 組和5 組）的過敏反應(yīng)則明顯減輕（與蝦蛋白或蝦肉組比較，P＜0.01），無死亡。

表3 過敏反應(yīng)結(jié)果與評分Table 3 Results and score of generalized anaphylaxis

6 組至9 組為灌胃給予不同劑量的蝦肉進行致敏，再灌胃給予致敏雙倍劑量的蝦肉進行激發(fā)，觀察豚鼠的過敏反應(yīng)。由表3 中的結(jié)果可以看出，蝦肉各劑量組豚鼠的過敏反應(yīng)強度與其劑量間將呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；8 組與4 組比較（同劑量，不同途徑致敏），豚鼠的過敏反應(yīng)有所減輕；將蝦肉溶液過濾后再灌胃（9 組），反應(yīng)與未過濾組（8 組）間無明顯差別。

10 組至13 組為灌胃給予不同劑量的蝦肉酶解產(chǎn)物進行致敏，再灌胃給予致敏雙倍劑量的蝦肉酶解產(chǎn)物進行激發(fā)，觀察豚鼠的過敏反應(yīng)。由結(jié)果可見，酶解產(chǎn)物各劑量組的豚鼠過敏反應(yīng)發(fā)生率仍很高，但反應(yīng)的程度較同劑量蝦肉組則明顯減輕；將酶解產(chǎn)物過濾后灌胃，過敏反應(yīng)也有較大的改善，反應(yīng)及評分與注射致敏組無明顯差別。

2.2 致敏豚鼠離體回腸平滑肌過敏性收縮試驗

各組分別用卵白蛋白、蝦蛋白、蝦肉以及蝦蛋白和蝦肉的木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物致敏，將致敏后的離體回腸用相應(yīng)殖民無進行攻擊，腸平滑肌收縮活動的變化見表4。

表4 中，1 組至5 組為腹腔注射致敏。由表4 中的結(jié)果可以看出，用卵白蛋白（1 組）、蝦蛋白（2 組）和蝦肉（4 組）致敏后的離體腸在受到相應(yīng)過敏原攻擊后，腸平滑肌的收縮力明顯增強，各組間差異無顯著性。蝦蛋白酶解產(chǎn)物致敏組（3 組）和蝦肉酶解產(chǎn)物致敏組（5 組）的腸平滑肌在受到相應(yīng)過敏原攻擊后，其收縮力無明顯變化，分別與蝦蛋白和蝦肉組進行比較，差異均十分顯著（P＜0.01）；蝦蛋白和蝦肉酶解產(chǎn)物組間的腸收縮力改變無顯著性差異。

表4 卵白蛋白、蝦蛋白、蝦肉以及木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的致敏作用比較Table 4 Comparison of sensitization among egg-white protein，shrimp protein and productions enzymolysised

6 組和7 組為灌胃給予蝦肉和蝦肉木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物進行致敏。由結(jié)果看出，經(jīng)灌胃途徑致敏的腸平滑肌攻擊前后腸收縮力的變化無論蝦肉致敏，還是酶解產(chǎn)物致敏，與腹腔注射途徑比較，腸收縮變化率均無顯著性差異；蝦肉酶解產(chǎn)物與蝦肉比較，腸收縮力變化十分顯著（P＜0.01）。

剪輯腸收縮曲線，圖中標(biāo)明致敏物質(zhì)及攻擊物質(zhì)，箭頭代表攻擊的時刻及攻擊物質(zhì)加入的量。結(jié)果見圖1。

3 討論

食物過敏是世界各地普遍存在的一個嚴(yán)重問題，有約33%左右的過敏反應(yīng)由食物引起，有時會出現(xiàn)過敏性休克，嚴(yán)重時甚至?xí)＜吧黐5-6]。食用蝦等海產(chǎn)品過敏引起過敏性休克的病例也時有發(fā)生[7-8]。研究者對165 例慢性蕁麻疹患者食物過敏原分析，對蟹過敏者占67.95%，對蝦過敏者占52.56%[1]。因此，設(shè)法消減蝦中的過敏原，讓人們吃的安全十分必要。

該實驗工藝制備的蝦肉蛋白粉及提取的蝦蛋白具有很強的致敏性，其過敏反應(yīng)的強度或效價與卵白蛋白相近。將該蝦肉及蝦蛋白經(jīng)木瓜蛋白酶水解得到酶解產(chǎn)物，將此產(chǎn)物給豚鼠進行注射和灌胃兩種途徑致敏，在全身過敏反應(yīng)及致敏的豚鼠回腸平滑肌收縮實驗中，酶解產(chǎn)物的致敏性均明顯降低，與酶聯(lián)免疫檢測的結(jié)果一致。實驗結(jié)果顯示，酶解產(chǎn)物中的過敏原未能完全消除，尤其灌胃直接給予酶解產(chǎn)物，過敏反應(yīng)雖明顯減輕，但發(fā)生率未見降低。將此酶解產(chǎn)物過濾后再進行致敏及激發(fā)，過敏反應(yīng)的發(fā)生率和過敏嚴(yán)重程度均明顯改善，可能蝦肉酶解產(chǎn)物中的未溶解物質(zhì)具有一定的致敏性。因此，建議在實際應(yīng)用此類產(chǎn)品進行食品制作前，要進行過濾處理，可以大大減少其中的致敏物質(zhì)；也可以進一步優(yōu)化提取和消減蝦肉過敏原的工藝，使過敏原消減效果更加理想。

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