犬布氏桿菌Cu/Zn-SOD基因的原核表達及多克隆抗體的制備

曾憲斌，熊永忠，賈 坤，張敦偉，佘利旋，夏惠焰，遠立國，李守軍*

(1.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州510642；2.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司，黑龍江哈爾濱150069)

犬布氏桿菌病(Canine Brucellosis)是由犬布氏桿菌(Brucella canis)引起的人畜共患傳染病。B.canis為粗糙型布氏桿菌，革蘭氏染色陰性。1966年Leland Carmichael首次分離到 B.canis。在我國，1984年尚德秋首次分離到B.canis。B.canis主要感染狗，還可以感染人、猴和兔。主要侵害宿主的生殖系統(tǒng)，引起感染宿主的不育，懷孕母畜流產，公畜附睪炎和前列腺炎，另外還可以引起全身性的淋巴結炎和眼葡萄膜炎。

犬布氏桿菌病的診斷方法有很多種，常用的有細菌分離培養(yǎng)、試管凝集試驗(TAT)、玻板凝集試驗、虎紅平板凝集試驗(RBPT)和瓊脂免疫凝膠擴散試驗(AGID)，但這些方法均存在一定缺陷。ELISA方法作為一種快速、敏感、特異的檢測方法，是公認的較有效的布氏桿菌病(Brucellosis)檢測方法。目前只有牛種和豬種布氏桿菌(Brucella)的ELISA試驗是國際貿易中的指定試驗。綿羊副睪種Brucella也已有成熟的ELISA診斷技術[1]。ELISA方法在檢測B.canis上的應用還需進一步改進抗原和積累數(shù)據(jù)。Cu/Zn-SOD是Brucella除沙林鼠種和豬種Brucella生物2型外，各生物型均表達的一個蛋白，是建立B.canisELISA檢測方法的候選抗原之一。本研究表達、純化了B.canis重組Cu/Zn-SOD蛋白，并檢測其免疫原性，為研究Cu/Zn-SOD蛋白在B.canis的ELISA檢測中的應用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 B.canis及陰性犬血清由本實驗室分離并保存；B.canis陽性血清由北京畜牧獸醫(yī)研究所提供；pMD18-T Simple Vector、pET-28a(+)Vector、ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、EcoRⅠ、HindⅢ、DNA Marker均購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒小量抽提試劑盒購自OMEGA公司；膠回收小量試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司；預染蛋白Marker購自Fermentas公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗犬IgG購自JACKSON公司；HRP標記的羊抗兔IgG購自天根生化科技有限公司；Ni-IDA蛋白純化柱購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 引物設計 參照GenBenk登錄的B.canis基因序列(ATCC 23365)，利用Primer 5生物軟件設計特異性引物擴增Cu/Zn-SOD基因，引物序列如下：P1：5'-ATGACGACGGTAAAAATGTATGAGG-3'；P2：5'-AAGCTTTTATTCGATCACGCCGCAG-3'，劃線部分分別為EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點。預期擴增產物為462 bp。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.3 Cu/Zn-SOD基因的PCR擴增 提取B.canis基因組DNA，并以其為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s、61℃ 40 s、72℃1 min，30個循環(huán)；72℃10 min。PCR產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 Cu/Zn-SOD基因PCR產物的克隆 將純化的PCR產物連接于pMD18-T載體中，并轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB瓊脂平板上，過夜培養(yǎng)后挑取白色單菌落，對菌液PCR鑒定陽性的克隆進行測序，并將測序結果與原序列進行比較分析。重組克隆質粒命名為pMD-SOD。

1.5 重組表達質粒的構建及鑒定 按E.N.Z.A質粒小量抽提試劑盒說明書抽提重組質粒pMD-SOD，采用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切并回收SOD基因，再將回收的SOD基因連接到經(jīng)同樣酶切的原核表達載體pET-28a(+)中，連接產物轉化于E.coliDH5α。重組表達質粒命名為pET-SOD。對重組表達質粒進行雙酶切鑒定并測序。

1.6 重組質粒的誘導表達、SDS-PAGE和western blot分析 將陽性重組質粒pET-SOD轉化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑選陽性菌進行誘導表達。于誘導后6 h取菌液進行SDS-PAGE和western blot鑒定。

1.7 SOD蛋白的純化及多克隆抗體的制備 將含有陽性重組質粒pET-SOD的BL21(DE3)菌液按1%比例接種于含卡那霉素(100 μg/mL)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，加入終濃度為1.0 mmol/L的無菌IPTG誘導。收集菌體，超聲破碎。按Ni-IDA蛋白純化柱說明書對超聲上清液進行純化。將純化蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻(蛋白終濃度為0.5mg/mL)，新西蘭兔背部皮下多點注射，每只3 mL。第2周和第4周分別將純化蛋白與等體積不完全弗氏佐劑充分混勻(蛋白終濃度為0.5 mg/mL)進行第2次和第3次免疫。在一免、二免、三免后第14 d分別耳靜脈采血，離心收集血清，進行western blot分析。三免后第14 d頸靜脈采血，離心收集血清，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結 果

2.1 Cu/Zn-SOD基因的擴增與重組表達質粒的酶切鑒定 Cu/Zn-SOD基因的PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，獲得條帶與預期產物大小一致(圖 1)。

對PCR鑒定陽性的菌擴大培養(yǎng)，抽提質粒。pET-SOD重組質粒經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，得到約5300 bp和460 bp的片段，表明構建了重組質粒pET-SOD。

2.2 重組蛋白的誘導表達 將經(jīng)1 mmol/L的IPTG誘導的pET-SOD/BL21菌體進行SDS-PAGE分析。結果表明，在20 ku左右出現(xiàn)一條明顯的條帶，與預期大小一致，表明該基因片段在大腸桿菌BL21中得到表達(圖2)。

2.3 Western blot檢測 重組表達蛋白進行western blot反應，結果顯示，20 ku處出現(xiàn)一條明顯的印跡，表明重組蛋白可以被B.canis陽性血清識別，具有良好的抗原性(圖3)。

2.4 兔抗Cu/Zn-SOD多克隆抗體的western blot分析 分別以一免、二免、三免第14 d的血清(1∶100稀釋)作為一抗進行western blot分析，結果表明在20 ku處均出現(xiàn)條帶，二免、三免第14 d抗體效價達到最高(圖4)。

3 討論

1999年～2007年間，日本報道了11例Brucellosis患者，其中7例由B.canis引起[2]。2008年，在日本又發(fā)現(xiàn)了兩例感染B.canis的患者[3]。在我國，隨著寵物行業(yè)的發(fā)展，B.canis對人類的健康威脅也越來越大。2009年何丹運用試管凝集試驗和虎紅平板凝集試驗，對中國農業(yè)大學動物醫(yī)院臨床采集的415份犬血清樣品進行犬布氏桿菌病血清學檢測，檢出陽性血清1例[4]。2006年樸東日從實驗動物比格犬中分離出2株B.canis，可見在中國部分地區(qū)存在B.canis的感染[5]。因此，深入研究B.canis致病機制和建立早期B.canis感染的快速檢測方法顯得越來越重要。目前，ELISA方法是公認檢測B.canis較有效的方法，而選擇合適的抗原是建立ELISA方法的關鍵。

Cu/Zn-SOD在Brucella的致病性和介導機體產生免疫反應方面的作用還存在爭議，可能原因是在光滑型Brucella中，其主要的毒力因子是LPS-O側鏈，在該因子的存在下，Cu/Zn-SOD的毒力被掩蓋而檢測不到，另外BrucellaCu/Zn-SOD與真核生物宿主存在部分同源性，所以很可能對部分同源的抗原產生體液免疫反應要比外源性抗原的時間長[6-9]。本研究中利用重組表達的Cu/Zn-SOD蛋白為抗原可以檢測B.canis陽性血清中的Cu/Zn-SOD的抗體。分析可能原因有：(1)B.canis是粗糙型Brucella，缺乏LPS-O側鏈，所以Cu/Zn-SOD的作用不會被掩蓋；(2)患犬感染B.canis的時間比較長，足以產生抗Cu/Zn-SOD的抗體。

本研究構建了B.canisCu/Zn-SOD基因的原核表達載體pET-SOD，將其進行表達、純化和western blot分析，重組蛋白Cu/Zn-SOD與B.canis陽性血清發(fā)生特異性反應；并制備了兔抗B.canis Cu/Zn-SOD多克隆抗體，經(jīng)western blot分析表明，該多克隆抗體可以與重組蛋白發(fā)生特異性反應，表明重組蛋白抗原性良好，為B.canisCu/Zn-SOD蛋白的免疫保護性研究和Cu/Zn-SOD蛋白在B.canis ELISA檢測中的應用奠定了基礎。

[1]Nielsen K.Diagnosis of brucellosis by serology[J].Vet Microbiol,2002,90:447-459.

[2]Imaoka K.Brucellosis(1999.4-2007.3)Infectious agents surveillance report in Japanese[J].Tokyo:Ministry of Health,Labour and Welfare;and National Institute of Infectious Diseases,2007,28:227-228.

[3]Nomura A,Imaoka K,Imanishi H,et al.HumanBrucella canis infections diagnosed by blood culture[J].Emerg Infect Dis,2010,16(7):1183-1184.

[4]何丹，韋海濤，施振聲，等.北京地區(qū)犬布氏桿菌病血清學調查[J].中國獸醫(yī)雜志，2009，45(2)：64-65.

[5]樸東日，趙鴻雁，李蘭玉，等.從北京某地分離2株犬種布氏菌的鑒定報告[J].中國地方病防治雜志，2006，21(5)：263-264.

[6]Latimer E J,Simmers N,Sriranganathan R M,et al.Brucella abortusdeficent in copper/zinc superoxide dismutase is virulent in BALB/C mice[J].Micro-Patho,1992,12:105-113.

[7]Tabatabai L B,Pugh G W Jr.Modulation of immune responses in Balb/c mice vaccinated withBrucella abortusCu-Zn superoxide dismutase synthetic peptide vaccine[J].Vaccine,1994,12(10):919-924.

[8]Vemulapalli R,Cravero S.Overexpression of protective antigen as a novel approach to enhance vaccine effcacy ofBrucella abortusstrain RB51[J].Infect Immun,2000,68:3286-3289

[9]唐瀏英.布魯氏菌以銅/鋅為輔基的超氧化物歧化酶的研究進展[J].中國地方病防治雜志，1996，11(1)：40-42.