抗藍(lán)舌病病毒VP7和NS2蛋白單克隆抗體的制備及鑒定

秦永麗， 孫恩成，耿宏偉,2，楊 濤，劉霓紅，趙 晶，王凌鳳，徐青元，蔡緒禹，李文京，吳東來*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室，黑龍江哈爾濱150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；3.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京100125)

藍(lán)舌病(Bluetongue，BT)是由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的BT病毒(BTV)引起的，主要由庫蠓傳播的反芻動物烈性非接觸性傳染病，其主要感染牛、羊和野生反芻動物等[1]。感染動物的平均病死率為30%，其中綿羊的病死率可高達(dá)80%[2]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將BT列為必須呈報的傳染病之一，我國將其劃定為一類動物疫病。BTV血清型眾多，目前已發(fā)現(xiàn)24個血清型，根據(jù)不同的地理位置又分為不同的亞型[3]。

BTV是雙鏈RNA病毒，其基因組由10個線性雙鏈RNA片段組成，共編碼10種蛋白，包括7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3a)。自2006年以來，BTV8在歐洲一些國家如比利時、荷蘭、法國、德國等爆發(fā)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時也擴(kuò)大了BTV的傳統(tǒng)分布范圍[4]。我國目前還未有BTV8流行的相關(guān)報道，但是隨著國際貿(mào)易的往來，BTV8隨時有可能傳入我國。所以，本研究利用BTV8全病毒顆粒為免疫原免疫BALB/c小鼠制備了單克隆抗體(MAb)，并通過western blot和間接免疫熒光(IFA)對其特性進(jìn)行鑒定，為建立BTV免疫學(xué)檢測方法和相關(guān)病毒蛋白功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與病毒株 BHK-21細(xì)胞、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞以及BTV1-24型病毒株由本實驗室保存。

1.2 實驗動物 6周齡～8周齡的BALB/c小鼠由哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。

1.3 主要試劑 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司；PEG4000、HAT、HT、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購自Sigma公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；鄰苯二胺(OPD)購自哈爾濱博瑞生物技術(shù)有限公司；預(yù)染蛋白Marker購自Fermentas公司；MAb亞型鑒定試劑盒購自Invitrogen公司。

1.4 BTV8增殖和TCID50測定 將第7代BTV8接種單層BHK-21細(xì)胞，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，72 h后待90%的BHK-21細(xì)胞產(chǎn)生病變時收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清，離心除去細(xì)胞碎片，將收集的上清進(jìn)行TCID50測定，確定BTV8病毒毒價[5]。

1.5 間接ELISA檢測方法的建立 按常規(guī)間接ELISA操作步驟，分別用BTV8全病毒和BHK-21作為包被抗原，經(jīng)方陣法確定抗原最佳包被濃度和陽性血清的最佳稀釋倍數(shù)。

1.6 動物免疫 將BTV8全病毒腹腔注射免疫6周齡～8周齡的BALB/c雌鼠5只，0.5 mL/只。每隔兩周進(jìn)行一次免疫，共免疫3次。分別在第2次和第3次免疫后一周斷尾采血，以建立的ELISA方法檢測血清效價。選取血清效價最高的小鼠在融合前3 d腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.7 細(xì)胞融合及MAb的制備 按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。待雜交瘤細(xì)胞生長至板底面積1/4～1/3后，用BTV8全病毒為包被抗原通過間接ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，同時將BHK-21細(xì)胞反復(fù)凍融3次，離心，以收集上清液為包被抗原作為陰性對照。對初步篩選的陽性克隆根據(jù)有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆。最后將得到的穩(wěn)定分泌特異性MAb的陽性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并將細(xì)胞凍存。收集上清液進(jìn)行western blot及IFA檢測，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。

1.8 MAb免疫球蛋白亞類鑒定 按照MAb亞類試劑盒說明書用ELISA方法進(jìn)行檢測。

1.9 Western blot鑒定 將離心收獲BTV8病毒上清液后的細(xì)胞沉淀和BHK-21細(xì)胞沉淀處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉液4℃封閉過夜。加入MAb上清室溫孵育1 h，用PBST洗滌3次，再與4000倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體室溫孵育1 h，PBST洗滌3次后，用DAB顯色試劑盒顯色，掃描記錄。

1.10 IFA鑒定 將BTV1-24型病毒株分別接種于單層BHK-21細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)病變時，棄掉培養(yǎng)液，加入70%預(yù)冷的無水乙醇，4℃固定30 min，用PBST洗滌3次。分別加入陽性、陰性鼠血清和MAb上清，同時設(shè)置未接種病毒細(xì)胞對照，37℃孵育1 h。以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，37℃避光孵育1 h。鏡檢，拍照。

2 結(jié) 果

2.1 BTV8培養(yǎng)和TCID50測定 將BTV8第7代病毒液接種于單層BHK-21細(xì)胞，獲得BTV8第8代病毒。按照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行TCID50測定，得到BTV8 TCID50為 10-8.25/0.1 mL。

2.2 間接ELISA方法的建立 經(jīng)方陣試驗確定ELISA方法的最佳反應(yīng)條件：最佳的抗原包被濃度為10-7.25TCID50，4℃反應(yīng)過夜；5%脫脂乳37℃封閉2 h，陰陽性血清的稀釋倍數(shù)為1∶1600；一抗(MAb上清)和羊抗鼠IgG二抗(1∶5000稀釋)均為37℃孵育1 h；底物顯色10 min。

2.3 MAb的制備 細(xì)胞融合后，初步檢測為陽性的細(xì)胞克隆經(jīng)過3次亞克隆后，共獲得8株穩(wěn)定分泌抗BTV8 MAb的陽性雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1B2、1F6、2B1、2D10、3B6、3D9、4D4 和 4D12。用上述間接ELISA方法測定雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清的效價(表 1)。

2.4 MAb免疫球蛋白亞類鑒定 經(jīng)MAb亞類鑒定試劑盒檢測，MAb 1B2、2B1、3D9、3B6、4D4亞類為 IgG1/κ 鏈；MAb 1F6、2D10、4D12亞類為IgG2a/κ 鏈(表 1)。

表1 MAb的特點Table 1 The characterization of MAb

2.5 Western blot鑒定 用8株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行western blot鑒定，結(jié)果表明，本研究所獲得的 MAb1F6、2B1、2D10、3B6、3D9 與 BTV8 VP7蛋白反應(yīng)，MAb B2、4D4、4D12與BTV8 NS2蛋白反應(yīng)。所有MAb均不與對照BHK-21細(xì)胞沉淀發(fā)生反應(yīng)(圖 1)。

2.6 IFA鑒定 用 1B2、1F6、2B1、2D10、3B6、3D9、4D4、4D128株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液對接種BTV1-24型病毒株的單層BHK-21細(xì)胞以及未接種病毒的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行IFA試驗，結(jié)果顯示這8株MAb與不同血清型的BTV反應(yīng)譜系有所不同(表 2)。

MAb 1B2、4D4、4D12可以與24個不同血清型BTV發(fā)生反應(yīng)，而其他MAb對不同血清型的BTV反應(yīng)性不 同，如 MAb 1F6與 BTV1、BTV7、BTV12、BTV13、BTV21呈弱陽性反應(yīng)，與BTV5、BTV6、BTV17呈陰性反應(yīng)；MAb B1與BTV7呈陰性反應(yīng)；MAb D10、3D9、3B6與 BTV7、BTV15、BTV19呈陰性反應(yīng)。

表2 IFA鑒定結(jié)果Table 2 The results of the identification of IFA against BTV

3 討論

近年來，隨著氣候變暖，BTV在全球范圍內(nèi)普遍流行，新的血清型不斷出現(xiàn)[7-8]。覃紹敏等對廣西山羊BT血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該地區(qū)山羊BTV感染現(xiàn)象普遍存在，陽性率為6.3%～45.1%，平均陽性率為20.5%[9]。目前國內(nèi)外還沒有能夠?qū)T進(jìn)行有效的防制的疫苗，所以提高BT的診斷技術(shù)是非常重要的。MAb是重要的免疫學(xué)工具，其在病原的生物學(xué)特性、抗原性的研究及病原的檢測、治療、免疫機(jī)制研究等方面均有重要的應(yīng)用價值。所以，本研究利用目前在歐洲各國流行的BTV8全病毒顆粒為免疫原，同時用其作為包被抗原篩選出10株穩(wěn)定分泌抗BTV8 MAb的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)鑒定這10株MAb效價高，生物學(xué)反應(yīng)特性各異，為今后BTV分子生物學(xué)特性研究及建立BTV免疫學(xué)檢測方法奠定了基礎(chǔ)。

BTV基因組編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3a)。VP7蛋白具有群特異性抗原決定簇，可以產(chǎn)生群特異性抗體，為BTV群特異性血清抗體檢測中的首選抗原[10]。但本研究通過IFA檢測表明與非結(jié)構(gòu)蛋白NS2反應(yīng)的MAb 1B2、4D4、4D12同樣可以與BTV1-24型血清型發(fā)生反應(yīng)，表明NS2蛋白也可以產(chǎn)生群特異性抗體，即同時證明He Cheng-qiang等的觀點，即NS2在不同血清型中是相對保守的[11]。此外，NS2蛋白在BTV感染過程中表達(dá)量大并且具有良好的抗原性，這也為BT血清型的檢測開辟了新的途徑。

[1]Fauquet C M,Mayo M A,Maniloff J,et al.Virus Taxonomy 8th Edition[M].USA:Elsevier Academic Press,2005:466-483.

[2]宋紅梅，楊濤，馬健男，等.藍(lán)舌病病毒VP7基因的原核表達(dá)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，31(12)：925-928.

[3]Toussaint J F,Sailleau C,Breard E,et al.Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two different genomic segments[J].J Virol Methods,2007,140(1-2):115-123.

[4]Mehlhorn H,Walldorf V,Klimpel S,et al.First occurrence of culicoides obsoletus-transmitted bluetongue virus epidemic in central Europe[J].Parasitol Res,2007,101(1):219-228.

[5]殷震，劉景華.動物病毒學(xué)(第二版)[M].北京：科學(xué)出版社，1997.

[6]Richards R G,MacLachlan N J,Heidner H W,et al.Comparison of virologic and serologic responses of lambs and calves infected with bluetongue virus serotype 10[J].Vet Microbiol,1988,18(3-4):233-242.

[7]Wilson A,Mellor P.Bluetongue in Europe:vectors,epidemiology and climate change[J].Parasitol Res,2008,103(11):69-77.

[8]Mann S,Mann N S,Nomikou K,et al.Novel bluetongue virus serotype from Kuwait[J].Emerg Infect Dis,2011,17(5):886-889.

[9]覃紹敏，白安斌，吳健敏，等.廣西山羊藍(lán)舌病血清學(xué)調(diào)查及流行區(qū)域分布的影響因素分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2011，33(1)：28-31.

[10]Le Blois H,Fayard B,Urakawa T,et al.Synthesis and characterization of chimeric particles between epizootichemorrhagic disease virus and bluetongue virus:functional domains are conserved on the VP3 protein[J].J Virol,1991,65(9):4821.

[11]He Cheng-qiang,Ding Nai-zheng,He Mei,et al.Intragenic recombination as a mechanism of genetic diversity in bluetongue virus[J].J Virol,2010,84(21):11487-11495.