大腸桿菌O111∶B4內(nèi)毒素對(duì)大鼠肝臟Fas蛋白表達(dá)的影響

李 勇，高 洪，嚴(yán)玉霖，楊桂梅，彭 潔，孔令青，劉海峰

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南省藥物研究所GLP中心，云南昆明650111；3.昆明醫(yī)學(xué)院，云南昆明650031；4.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650212)

內(nèi)毒素(Endotoxin，ET)是革蘭氏陰性細(xì)菌(Gram negative bacteria，GNB)細(xì)胞壁外膜的組成成分，其化學(xué)本質(zhì)為脂多糖(LPS)，它作為GNB的主要致病因子，在GNB感染中發(fā)揮著重要作用，常造成人畜ET血癥和ET休克，嚴(yán)重危害人畜健康。肝臟既是清除ET的場所，同時(shí)又是ET血癥、休克過程中最易受損的器官之一[1]。近年來研究表明，細(xì)胞凋亡與肝損傷有著密切的聯(lián)系，在許多肝臟疾病中均有細(xì)胞凋亡的發(fā)生，它往往通過直接或間接的途徑造成肝臟損傷。Fas/FasL系統(tǒng)是目前研究較為深入的一類與凋亡有關(guān)的基因系統(tǒng)，而由Fas基因表達(dá)的Fas蛋白是一種促凋亡蛋白[2-4]。大量研究表明，F(xiàn)as/FasL途徑是肝細(xì)胞的主要凋亡路徑[5-8]。而肝細(xì)胞凋亡是造成肝損傷的原因之一，Erwei等[9]利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，使Fas蛋白表達(dá)沉默，凋亡減少，保護(hù)肝細(xì)胞免受細(xì)胞毒性作用，從而避免肝臟受損。而ET能夠有效地促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，從而造成肝損傷[10-11]。但在此過程中，ET對(duì)大鼠肝細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立ET致大鼠肝臟損傷模型，應(yīng)用western blot和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，探討ET對(duì)大鼠肝細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器 大腸桿菌O111∶B4內(nèi)毒素(L2630)購自美國Sigma公司；Fas兔多克隆 抗 體(BA0484)、HRP-羊 抗 兔 IgG(BA1054)、β-Actin鼠單克隆抗體(BM 0627)、HRP-羊抗鼠IgG(BA1050)均購自武漢博士德生物公司；異硫氰酸熒光素(FITC)-羊抗兔IgG(ZF-0311)、濃縮型DAB試劑盒(ZLI9017)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；NC膜購自美國M illipore公司；SD大鼠由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供；FACS Vantage SE流式細(xì)胞儀為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品；超速冷凍離心機(jī)為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；DYCZ-24DN型垂直電泳槽和DYCZ-40D轉(zhuǎn)移槽均為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物分組、處理與樣品制備 48只實(shí)驗(yàn)用SD大鼠，體質(zhì)量140g～160g，雌(無孕)雄不限。臨床檢查確認(rèn)健康后，預(yù)飼養(yǎng)3d，自由飲水，隨機(jī)分為2組：第Ⅰ組為試驗(yàn)組(n=24)，按5mg/kg劑量尾靜脈注射ET(1mg/m L)；第Ⅱ組為對(duì)照組(n=24)，按5m L/kg劑量尾靜脈注射無熱源生理鹽水；兩組大鼠分別于3h、4h、8h和12h各迫殺6只，采集肝臟。一部分用于Fas蛋白的western blot檢測(cè)；另一部分用于Fas蛋白的FCM檢測(cè)。

1.3 肝臟Fas蛋白的western blot檢測(cè) 組織經(jīng)研磨離心后，獲得蛋白樣品，取適量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，而后轉(zhuǎn)印至NC膜進(jìn)行western blot檢測(cè)，一抗為Fas蛋白兔多克隆抗體(1∶300)，二抗為HRP-羊抗兔 IgG(1∶300)， DAB顯色，利用 Quantity one 4.6.2軟件掃描分析條帶灰度值，與內(nèi)參條帶灰度值之比作為結(jié)果。

1.4 肝臟Fas蛋白的FCM檢測(cè) 取適量肝臟組織于200目尼龍篩搓取，將濾液于2000r/min離心5min，清洗兩次；加入4%多聚甲醛，室溫固定15m in后1800r/min離心5min去上清，清洗；分別加入1∶100稀釋的Fas兔多克隆抗體和1∶50稀釋的FITC-羊抗兔IgG各避光37℃水浴孵育40m in，并清洗；最后加入冷PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×106/m L～5×106/m L。取 0.3m L細(xì)胞懸液于FACS Vantage SE流式細(xì)胞儀，采用Cell quest軟件獲取細(xì)胞并進(jìn)行測(cè)定，以W inMDI2.9軟件分析并經(jīng)計(jì)算機(jī)處理得出蛋白的表達(dá)率。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析 各組數(shù)據(jù)以平均值(X)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，組間差異采取顯著性t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 肝臟Fas蛋白的western blot檢測(cè)結(jié)果 肝臟Fas蛋白表達(dá)的western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組Fas蛋白的表達(dá)隨時(shí)間的推移呈增加趨勢(shì)(圖1)，其灰度值明顯高于對(duì)照組(p<0.01)，并且始終呈上升趨勢(shì)(表 1)。

表1 肝臟Fas蛋白的表達(dá)結(jié)果(灰度值比)(n=6,X±SD)Table 1The expression results of Fas protein in liver(relative values of expression levels)(n=6,X±SD)

2.2 肝臟Fas蛋白的FCM檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果圖中橫坐標(biāo)表示細(xì)胞大小，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，根據(jù)強(qiáng)度大小自動(dòng)換算為信道數(shù)值分別以線性和對(duì)數(shù)形式表示。根據(jù)默認(rèn)值分為4個(gè)象限，其中B象限、D象限為細(xì)胞團(tuán)塊或多細(xì)胞集聚體，C象限為細(xì)胞與熒光抗體的非特異結(jié)合，所以僅A象限數(shù)據(jù)為有效表達(dá)率。結(jié)果顯示，F(xiàn)as蛋白隨時(shí)間延長表達(dá)量增加(圖2)；表達(dá)率明顯高于對(duì)照組(p<0.01)，并且呈上升趨勢(shì)(表2)。

表2 肝臟Fas蛋白的表達(dá)結(jié)果(表達(dá)率，%)Table 2The expression results of Fas protein in liver(expression rates,%)(n=6,X±s)

3 討 論

ET在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)受血漿和細(xì)胞內(nèi)的多種內(nèi)源性物質(zhì)的調(diào)節(jié)。其中脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)與LPS刺激肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的關(guān)系最為密切，LBP與LPS結(jié)合為可溶性LBP-LPS復(fù)合體，再與肝細(xì)胞表面的CD14受體結(jié)合并直接作用于肝細(xì)胞，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞Fas配體(FasL)等基因的表達(dá)[12]。

本研究采用western blot和FCM相結(jié)合的方法對(duì)ET致大鼠肝損傷中Fas蛋白表達(dá)的變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：對(duì)照組和試驗(yàn)組大鼠肝臟均有Fas蛋白的表達(dá)，對(duì)照組肝臟Fas蛋白表達(dá)均明顯低于試驗(yàn)組，并且試驗(yàn)組Fas蛋白表達(dá)隨著時(shí)間的延長而增加。Fas是一種促凋亡蛋白，F(xiàn)asL與Fas的結(jié)合導(dǎo)致Fas胞內(nèi)的死亡域形成三聚體的活化形式，隨后引起與之結(jié)合的Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)構(gòu)象發(fā)生改變，F(xiàn)ADD通過其死亡效應(yīng)功能區(qū)(DED)再與第3個(gè)N末端有該同源功能區(qū)稱為Fas激活的FADD樣白介素1-β轉(zhuǎn)化酶(ICE)結(jié)合導(dǎo)致后者的活化并被裂解，其裂解產(chǎn)物p10和p20亞基形成異聚體后即成為有活性的半胱氨酸蛋白酶，從而啟動(dòng)ICE相關(guān)蛋白酶及caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[13-14]。本研究結(jié)果表明在ET作用下Fas蛋白表達(dá)隨時(shí)間推移而增加，而在Fas蛋白的促凋亡作用下，肝細(xì)胞的凋亡也隨時(shí)間的推移而加劇，在一定程度上造成肝臟的損傷?？梢奅T能夠誘導(dǎo)Fas蛋白表達(dá)的上調(diào)從而促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，是ET致肝損傷的機(jī)制之一。

本研究中，試驗(yàn)組Fas蛋白表達(dá)隨時(shí)間推移而逐漸增加，與對(duì)照組相比ET明顯表現(xiàn)出對(duì)Fas蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，而Fas蛋白的促凋亡作用依賴于一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；同樣在ET血癥及ET性休克過程中也伴隨著多條ET信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它們彼此之間是否共同作用造成肝損傷？其共同作用的聯(lián)系如何？以及ET促進(jìn)Fas蛋白表達(dá)更深層的機(jī)制又是什么？這些問題還有待于深入的研究和探討。

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