一株血清7型致病性豬鏈球菌的分離鑒定

王淑杰，徐 敏，劉永剛，石文達(dá)，武嘉男，劉 鶴，何玉利，姜成剛，韓梓峰，蔡雪輝*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/疫病診斷中心，黑龍江哈爾濱150001；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640)

豬鏈球菌(Streptococcus suis)可以導(dǎo)致豬急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎及急性死亡，主要通過(guò)傷口和呼吸道等途徑導(dǎo)致人感染發(fā)病甚至死亡[1-2]。S.suis是一種重要的人畜共患病原，目前已建立了S.suis的血清分型及毒力相關(guān)基因的PCR檢測(cè)方法，但由于非致病菌株也不同程度攜帶sly、m rp、ef基因或表現(xiàn)血清2型，因此其分析結(jié)果仍無(wú)法確定致病性。世界范圍內(nèi)S.suis 2型是流行最廣泛的一種血清型。近年來(lái)，S.suis在我國(guó)很多省區(qū)流行或暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。本實(shí)驗(yàn)于2007年自黑龍江省五常地區(qū)1例病死豬的腦組織中分離一株病原菌，經(jīng)鑒定為S.suis血清7型。該分離株源于散發(fā)感染病例，并且在時(shí)間、地域及臨床致病性方面具有較好的代表性，對(duì)于S.suis血清7型的進(jìn)化溯源研究具有較大價(jià)值，本研究對(duì)其病原生物學(xué)特性進(jìn)行系統(tǒng)鑒定和分析，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、病料樣品和主要試劑 R735株和標(biāo)準(zhǔn)7型菌株8074株由本實(shí)驗(yàn)室保存；病料樣品來(lái)源于黑龍江省五常地區(qū)的病豬腦組織；標(biāo)準(zhǔn)S.suis 1型、2型、7型和9型血清購(gòu)自丹麥；標(biāo)準(zhǔn)2型菌株革蘭氏染液、鮮血瓊脂平板、Todd-Hew itt肉湯(THB)和瓊脂購(gòu)自O(shè)XOID公司；Taq DNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購(gòu)自TianGen公司；細(xì)菌生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；純系斑馬魚(yú)購(gòu)自上海國(guó)家斑馬魚(yú)模式動(dòng)物中心；30日齡實(shí)驗(yàn)仔豬購(gòu)自S.suis病原和抗體均為陰性的豬場(chǎng)。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化 將病料樣品于血平板上劃線培養(yǎng)，挑取可疑菌落經(jīng)液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h。將經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌落在平板上劃線純培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定篩選陽(yáng)性克隆獲得純培養(yǎng)物。

1.3 革蘭氏染色鏡檢 采用常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.4 生化試驗(yàn) 挑取純培養(yǎng)的單菌落接種細(xì)菌生化微量鑒定管，按照使用說(shuō)明書(shū)37℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。

1.5 分離株的PCR鑒定 參照文獻(xiàn)[3]合成引物，gdhU：5'-GCAGCGTATTCTGTCAAAC G-3'和 gdhL：5'-CCATGGACAGATAAAGATGG-3'，擴(kuò)增片段大小為 688bp； cps7U： 5'-AATGCCCTCG TGGAATACAG-3'和 cps7L：5'-TCCTGACACCAGG ACACGTA-3'，擴(kuò)增片段大小為378bp。分別進(jìn)行g(shù)dh基因檢測(cè)和cps1、cps2、cps7、cps94個(gè)血清型的分型鑒定。PCR反應(yīng)條件為：95℃5m in；94℃45s、55℃ 45s、72℃ 45s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10m in。

1.6 血清學(xué)鑒定 采用玻板凝集法以適當(dāng)稀釋的S.suis 1型、2型、7型和9型標(biāo)準(zhǔn)血清分別與純化的單菌落進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。

1.7 豬鏈球菌毒力表型鑒定 用PCR方法檢測(cè)分離菌株的溶菌酶釋放蛋白(m rp)、胞外蛋白因子(ef)、溶血素(sly)基因。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5min；94℃45s、50℃45s、72℃45s，30個(gè)循環(huán)；72℃10m in。引物為：m rpU：5'-ATCAG AATCACCACT TTTGG-3'和 m rpL：5'-TCATACCCAGTAAATACA CG-3'，擴(kuò)增片段大小為885bp；efU：5'-CGCAGAC AACGAAAGATTGA-3'和 efL：5'-AAG AATGTCT TTGGCGATGG-3'，擴(kuò)增片段大小為 744bp；slyU：5'-GCTTTATTGCGTGCTGAC-3'和 slyL：5'-CTGTTC TCCACCACTCCC-3'，擴(kuò)增片段大小為1097bp。

1.8 分離株對(duì)斑馬魚(yú)的致病性試驗(yàn) 采用平板計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)菌濃度，離心沉淀后以等量PBS重懸。取細(xì)菌PBS懸液，10倍倍比稀釋為5個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度腹腔注射接種50μL接種10尾斑馬魚(yú)；同時(shí)設(shè)等量PBS對(duì)照組，分別飼養(yǎng)。接種后96h統(tǒng)計(jì)各組斑馬魚(yú)死亡數(shù)量，按Reed-Muench法計(jì)算各菌株的LD50。無(wú)菌采取死亡斑馬魚(yú)的腹腔臟器進(jìn)行細(xì)菌分離，觀察其菌落形態(tài)、生長(zhǎng)特性和生化特性。

1.9 分離株對(duì)仔豬的致病性試驗(yàn) 以109CFU劑量于前腔靜脈接種2頭仔豬，同時(shí)設(shè)對(duì)照組。接種后連續(xù)觀察7d，當(dāng)臨床癥狀結(jié)束時(shí)采取組織樣品(扁桃體、關(guān)節(jié)、腦脊液、心臟、肝臟、肺、脾、腎、血和腦)涂板分離病菌并進(jìn)行病理切片。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)特征 病料樣品培養(yǎng)24h后，在血瓊脂平板上形成灰白色、半透明、邊緣整齊、光滑型的圓形小菌落，直徑約為1.0mm，有草綠色狹窄溶血環(huán)。染色鏡檢可觀察到散在排列的革蘭氏陽(yáng)性短鏈球菌(圖1)。

2.2 生化鑒定結(jié)果 將分離株及標(biāo)準(zhǔn)菌株于細(xì)菌生化微量鑒定管中37℃培養(yǎng)24h(表1)。該結(jié)果與S.suis生化特性基本一致。

2.3 PCR鑒定結(jié)果 以分離株基因組DNA為模板經(jīng)PCR檢測(cè)后，S.suis gdh基因的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，確定為S.suis；S.suis的cps1、cps2、cps7和cps94個(gè)血清型的分型鑒定結(jié)果為cps7陽(yáng)性，cps1、cps2和cps9為陰性，因此該分離株為S.suis 7型(圖2)。

表1 分離株的發(fā)病規(guī)律Table 1Disease regulation of isolates in fox

2.4 血清學(xué)鑒定結(jié)果 分離株與7型S.suis標(biāo)準(zhǔn)血清發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)，而與1型、2型、9型S.suis標(biāo)準(zhǔn)血清均無(wú)凝集顆粒。生化反應(yīng)、PCR反應(yīng)及血清學(xué)反應(yīng)均表明該分離株為S.suis，因此根據(jù)分離的時(shí)間和地點(diǎn)將該分離株命名為S.suis 7型07WC11株。

2.5 毒力因子檢測(cè)結(jié)果 采用PCR方法檢測(cè)分離株的毒力因子，S.suis 7型07WC11株和標(biāo)準(zhǔn)S.suis 7型菌株8074、標(biāo)準(zhǔn)S.suis 2型菌株R735的毒力因子檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各菌株毒力因子的檢測(cè)結(jié)果Table 2Detection result of the virulence factor of the strains of S.suis

2.6 對(duì)斑馬魚(yú)致病性測(cè)定結(jié)果 分離株對(duì)斑馬魚(yú)的致病性結(jié)果表明該分離株與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比致病性較強(qiáng)(表3)。斑馬魚(yú)在接種細(xì)菌24h后出現(xiàn)臨床癥狀并發(fā)生死亡，主要表現(xiàn)為腮部和下腹部出血。所有死亡斑馬魚(yú)腹腔臟器均可分離到細(xì)菌，其血清型、培養(yǎng)特性、生化特性以及毒力基因等特點(diǎn)均與接種菌株一致。對(duì)照組的斑馬魚(yú)未表現(xiàn)任何癥狀。

表3 各菌株LD50測(cè)定結(jié)果Table 3The LD50 of the strains of S.suis

2.7 對(duì)仔豬致病性測(cè)定結(jié)果 以07WC11株對(duì)30日齡仔豬進(jìn)行致病性試驗(yàn)，結(jié)果顯示仔豬在接種細(xì)菌2d后出現(xiàn)體溫升高、耳部發(fā)紫、腹瀉、消瘦等癥狀。剖檢可見(jiàn)頜下淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)腫脹出血、肺臟腎臟有出血點(diǎn)。病理切片可見(jiàn)大腦輕度水腫、肺臟小血管內(nèi)有血栓形成、肺泡隔增寬；腎臟間質(zhì)內(nèi)有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)；在各臟器均分離到細(xì)菌，經(jīng)鑒定為07WC11株。

3 討論

在歐洲，法國(guó)、意大利、西班牙，S.suis 2型是流行最廣泛的血清型[4-6]；而在比利時(shí)、荷蘭、德國(guó)和澳大利亞，血清9型最流行[7-8]；血清7型則在芬蘭最流行。在蘇格蘭，14型是流行最廣泛的血清型；而英國(guó)則主要是1型和14型流行[5,8]。在北美，加拿大S.suis 2型的比例由22%下降到15%[9]。中國(guó)近年來(lái)也常有S.suis 2型的報(bào)道，而本實(shí)驗(yàn)室在近3年的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)S.suis 7型所占的比例較大，在某些地區(qū)甚至超過(guò)了2型。S.suis不同血清型菌株之間毒力有較大差異，并非所有的血清型均具有致病性，相同血清型的不同分離株致病特性也不盡相同。S.suis的毒力相關(guān)因子包括莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、胞外因子、溶血素、纖連蛋白結(jié)合蛋白及膜蛋白轉(zhuǎn)肽酶等，可能在感染致病的不同階段發(fā)揮作用[6,11-13]。此外，有些弱毒株及非致病株也存在某些致病因子，因此，菌株的致病性必須通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致病性進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)選用斑馬魚(yú)作為模式動(dòng)物，對(duì)臨床分離的S.suis進(jìn)行致病性測(cè)定，并進(jìn)行S.suis 7型的致病性測(cè)定，結(jié)果表明斑馬魚(yú)對(duì)S.suis 7型易感。

本實(shí)驗(yàn)以所分離的7型07WC11株對(duì)實(shí)驗(yàn)仔豬進(jìn)行接種，結(jié)果表明該分離株具有一定的致病性。但該次致病性試驗(yàn)并未致死仔豬，這可能是由于注射用菌經(jīng)過(guò)多次傳代致病力有所下降所致，也可能與接種的劑量及接種的途徑有關(guān)。本研究分離獲得的豬源致病性S.suis 7型07WC11株，毒力比國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株強(qiáng)，其基本生物學(xué)特性、主要毒力基因型與后者無(wú)顯著差異。該菌株的分離和鑒定為深入研究S.suis 7型的致病性以及其基因組進(jìn)化奠定了基礎(chǔ)，對(duì)尋找S.suis 7型的致病因子具有重要價(jià)值。

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