通城虎鎮(zhèn)痛抗炎作用及急性毒性的實驗研究

韋健全 羅 瑩 黃 健 潘 勇 薛 強 鄭子敏 (右江民族醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

通城虎〔1，2〕，為馬兜鈴科植物通城虎 Aristolochia fordiana Hemsl.的根或會株及馬兜鈴全株，又名，五虎通城、定心草、天然草、血萎、血藤暗消、一點血。性味苦、辛、溫;小毒，具有祛風(fēng)、鎮(zhèn)痛、消腫、解毒。主治風(fēng)濕骨痛、胃脘痛、腹痛、咽喉炎、跌打損傷、小兒驚風(fēng)、毒蛇咬傷。本地民間常用其來治療風(fēng)濕痛及其他疼痛;目前有關(guān)通城虎相關(guān)的藥效學(xué)研究鮮見報道，為此我們用現(xiàn)代藥理學(xué)方法對其提取物的鎮(zhèn)痛抗炎作用及急性毒性進(jìn)行了實驗研究，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 通城虎，2007年8月購自百色市大菜市，經(jīng)我院附屬醫(yī)院中藥房劉春榮副主任藥師鑒定。藥材在室溫(25℃～30℃)下晾干，粉碎備用。

1.1.2 藥物制備 通城虎的提取:取粉碎后的通城虎藥粉800 g，用10倍水浸泡1 h，煮沸1 h，提取2次，過濾，合并濾液，濃縮至200 ml(每毫升提取液相當(dāng)于4 g生藥)，用時再配成相應(yīng)的濃度。吲哚美辛腸溶片，江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號0710022。醋酸地塞米松片，浙江仙居制藥廠，批號070340。二甲苯(汕頭市光華化學(xué)廠)，批號20061209。角叉菜膠 (Sigma公司)。

1.1.3 動物 小白鼠，昆明種，體重18～20 g;健康Wistar大鼠，體重180～250 g。均由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號:SCXK桂2003-0003。

1.1.4 儀器 電子分析天平(AR1140/C)，奧豪斯(上海)公司生產(chǎn);YLS-6B智能熱板儀、YLS-7B足趾容積測量儀、YLS-Q4耳腫打耳器，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站生產(chǎn);722可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響〔3〕將健康昆明種小鼠隨機分為5組，每組10只，分別為:(1)空白對照組(生理鹽水，等容積);(2)陽性對照組(吲哚美辛0.01 g/kg);(3)通城虎大、中、小劑量組(20、10、5 g/kg通城虎)。灌胃給藥 1次0.1 ml/10 g，給藥60 min后，腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 ml/10 g，記錄15 min內(nèi)小鼠扭體反應(yīng)(腹部內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行)次數(shù)，求藥物對扭體反應(yīng)的抑制率。抑制率(%)=(生理鹽水組平均扭體均數(shù)－試藥組平均扭體均數(shù))/生理鹽水組平均扭體均數(shù)×100%。

1.2.2 對小鼠熱板痛反應(yīng)的影響〔3〕將雌性小鼠置于(55±0.5)℃的智能熱板儀上，記錄小鼠足底接觸熱板至出現(xiàn)舔后足反應(yīng)的潛伏期(s)為痛閾指標(biāo)，剔除反應(yīng)潛伏期＜5 s或＞30 s的或跳躍的小鼠。選取反應(yīng)潛伏期在10～30 s內(nèi)的合格小鼠50只，根據(jù)藥前痛閾和體重隨機分成5組，分組及劑量同

1.2.1 ，每組10只。各鼠測2次痛閾，取平均值作為基礎(chǔ)痛閾。然后灌胃通城虎或吲哚美辛1次，于藥后30，60，120 min分別測定各鼠的痛閾1次，痛閾值超過60 s者以60 s計算。比較各組藥后不同時間痛閾值組間差異，判斷是否有鎮(zhèn)痛作用。

1.2.3 對二甲苯致小鼠耳殼腫脹的影響〔3〕分組及劑量同

1.2.1 ，陽性對照組(醋酸地塞米松0.005 g/kg)，灌胃給藥每天1次，連續(xù)3 d，最后一次給藥1 h后，各鼠左耳涂0.05 ml二甲苯致炎(在藥學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行)。致炎30 min后頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右兩耳，用直徑耳腫打耳器(8 mm)在同一部位沖下耳片，用電子天平稱重，以左右耳片重量(mg)差值表示炎性腫脹度并計算腫脹抑制率。腫脹抑制率(%)=(生理鹽水組平均腫脹度－給藥組平均腫脹度)/生理鹽水組平均腫脹度×100%。

1.2.4 對角叉菜所致足腫脹的影響〔3，4〕大鼠50只，隨機分5組，分組及劑量同1.2.3。實驗前禁食12 h(不禁水)，測定每鼠致炎前的右后足趾容積。灌胃給藥每天1次，連續(xù)3 d。末次給藥60 min后，各大鼠右后足趾皮下注射1%角叉菜0.1 ml，于注射后0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h分別測定各鼠右后足趾容積，比較各組大鼠致炎后不同時間右后足趾腫脹率。腫脹率(%)=(致炎后足趾容積-致炎前足趾容積)/致炎前足趾容積×100%。

1.2.5 對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響〔4〕取健康雄性小鼠50只，分組及給藥方法1.2.3，末次給藥后1 h，小鼠尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)溶液0.1 ml/10 g，隨即腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 ml/只，20 min后頸椎脫臼處死，剪開腹部肌肉，用6 ml生理鹽水分3次沖洗小鼠腹腔，收集沖洗液，4 000 r/min離心10 min，取上清液于590 nm處比色，以吸收度A值判斷小鼠腹腔毛細(xì)血管的通透性。抑制率(%)=(對照組平均吸光度-給藥組平均吸光度)/對照組平均吸光度×100%。

1.2.6 急性毒性試驗〔4〕預(yù)試驗，找出0%動物死亡的最小劑量(Dn)和100%動物死亡的最大劑量(Dm)致死劑量，求出組間比(r)。r=(Dm/Dn)1/(G-1)，G為組數(shù)，本實驗分為5個組，劑量分別為 60，76.6，97.8，124.9，160 g/kg(r=1.277，大/小相鄰組劑量等比級數(shù)為1∶0.78)，禁食12 h，不禁水，正式實驗時分別灌胃給藥一次，連續(xù)觀察7 d，記錄動物死亡動物數(shù)及毒性反應(yīng)情況。死亡動物解剖后肉眼觀察心、肝、腎、肺、脾等重要器官改變。

2 結(jié)果

2.1 通城虎對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響 見表1。通城虎20、10、5 g生藥/kg均能顯著減少醋酸所致的小鼠扭體次數(shù)，與生理鹽水組比較有顯著性差異，鎮(zhèn)痛率與劑量相關(guān)。20 g生藥/kg通城虎與10 mg/kg吲哚美辛對扭體反應(yīng)的抑制率相當(dāng)，但在使用10 mg/kg吲哚美辛?xí)r，小鼠活動與生理鹽水組比較明顯減少。

表1 通城虎對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s，n=10)

表1 通城虎對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響(±s，n=10)

與生理鹽水組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

組別 劑量(g/kg) 扭體次數(shù)(次/15 min) 抑制率(%)35.59±6.36 －吲哚美辛 0.01 10.95±2.732) 69.23通城虎 20 11.55±2.892) 67.55 10 22.70±5.272) 36.22 5 29.40±4.201)生理鹽水 －17.39

2.2 通城虎對小鼠熱板痛反應(yīng)的影響 通城虎20、10 g/kg兩個劑量能夠能顯著提高小鼠熱刺激體表的痛閾，與生理鹽水組進(jìn)行組間t檢驗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.3 通城虎對二甲苯致小鼠耳殼腫脹的影響 20、10、5 g/kg劑量通城虎對二甲苯所致的鼠耳腫脹的抑制作用非常顯著(見表3)。其中，5mg/kg地塞米松組作用最強，而且該組的小鼠較其他組的明顯活躍，可能與其興奮中樞有關(guān)。

表2 通城虎對小鼠熱板痛反應(yīng)時間的影響(±s，n=10)

表2 通城虎對小鼠熱板痛反應(yīng)時間的影響(±s，n=10)

組別 劑量(g/kg)痛閾值(s)基礎(chǔ)痛閾30 min 60 min 120 min生理鹽水 － 16.44±4.95 17.29±4.81 18.15±4.14 20.68±4.48吲哚美辛 0.01 15.93±5.09 24.28±4.202)31.01±4.862)37.85±5.292)通城虎 20 16.04±4.85 22.76±3.711)28.80±4.772)33.02±5.252)10 16.07±4.81 19.03±3.24 26.03±5.152)29.19±5.222)5 16.57±5.03 17.95±4.42 20.95±4.19 23.32±4.63

表3 通城虎對小鼠耳廓腫脹的影響(±s，n=10)

表3 通城虎對小鼠耳廓腫脹的影響(±s，n=10)

組別 劑量(g/kg) 腫脹度(mg) 抑制率(%)29.53±4.28 －地塞米松 0.005 11.19±3.212) 62.09通城虎 20 13.66±3.742) 53.72 10 18.30±4.292) 38.01 5 22.74±3.992)生理鹽水 －22.98

2.4 通城虎對角叉菜所致足腫脹的影響 通城虎20、10、5 g/kg劑量均能顯著抑制角叉菜膠所致小鼠足跖腫脹，而且效果持續(xù)時間較長，但抑制程度較地塞米松稍弱。見表4。

表4 通城虎對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響(±s，n=10)

表4 通城虎對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響(±s，n=10)

0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h生理鹽水 － 27.6±5.3 34.1±4.7 40.1±5.0 61.7±5.8 83.5±5組別 劑量(g/kg)致炎后不同時間足趾腫脹率(%).5地塞米松0.005 13.7±3.82)18.0±4.02)20.6±4.02)25.4±4.12)32.0±5.22)通城虎 20 19.3±4.82)21.5±4.92)22.8±5.02)30.3±4.42)43.1±4.72)10 23.8±4.9 26.6±4.62)29.3±4.52)37.1±4.42)56.9±5.62)5 26.9±5.0 29.6±3.61)35.5±4.41)56.1±5.51)77.6±5.81)

2.5 通城虎對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響 20、10、5 g/kg劑量通城虎對醋酸引起的腹腔毛細(xì)血管通透性有非常顯著的抑制作用，各組的抑制率有明顯的劑量依賴性。見表5。

表5 通城虎對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響(±s，n=10)

表5 通城虎對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響(±s，n=10)

組別 劑量(g/kg) 吸光度 抑制率(%)0.542±0.087 0地塞米松 0.005 0.296±0.0752) 45.3通城虎 20 0.313±0.0572) 42.2 10 0.354±0.0722) 34.7 5 0.411±0.0842)生理鹽水 －24.2

2.6 急性毒性試驗 小鼠灌胃通城虎后，大部分動物出現(xiàn)活動減少、蜷曲、呼吸減慢，動物多在72 h內(nèi)中毒死亡。死亡動物解剖肉眼觀察，腎臟顏色較白且出現(xiàn)輕度水腫;心、肝、肺、脾等重要器官未見出血、壞死等異常表現(xiàn)。小鼠灌胃通城虎的LD50為100.1 g/kg，LD50的95%可信限為87.2～115.1 g/kg。因此，其在一定劑量范圍內(nèi)應(yīng)用是安全的。

3 討論

本研究采用2種鎮(zhèn)痛實驗?zāi)Ｐ秃?種實驗性炎癥模型，即醋酸所致扭體和熱板法以及二甲苯致小鼠耳廓腫脹、角叉菜膠致小鼠足跖腫脹、小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性炎癥模型來檢測藥物的抗炎鎮(zhèn)痛活性。鎮(zhèn)痛實驗結(jié)果證明，通城虎20、10 g/kg兩個劑量能抑制醋酸刺激腹腔黏膜引起的痛反應(yīng)，減少各鼠的扭體次數(shù)，提高小鼠熱刺激體表的痛閾，延長熱板痛反應(yīng)時間。說明通城虎具有鎮(zhèn)痛作用。另外，通城虎對二甲苯所致小鼠耳片腫脹、角叉菜膠所致小鼠足腫脹以及小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性均有顯著的抑制作用，而且其抑制效果隨劑量呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。說明通城虎能夠有效緩解炎癥發(fā)生過程中的早期癥狀。急性毒性實驗的結(jié)果小鼠ig通城虎的LD50為100.1 g/kg，LD50的95%可信限為87.2～115.1 g/kg。如按通城虎生藥、藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算〔5〕，以及成人60 kg體重計算，即得相當(dāng)于486.5 g生藥，根據(jù)化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，它屬于低毒，而本品推薦最高用量為9 g，相當(dāng)于成人用量的54倍，由于不同地域的通城虎毒性成分含量可能不同，在使用要特別注意觀察。另一方面，通城虎根含馬兜鈴酸A，7-羥基馬兜鈴酸A及木蘭花堿馬兜鈴總酸性成分含量為0.60%，可引起“馬兜鈴酸腎病”(AAN)，出現(xiàn)進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化;還可致癌致突變〔6〕。由于通城虎具有較好的鎮(zhèn)痛作用，在本地民間變?yōu)橐环N習(xí)用藥材，在使用時一定要注意適應(yīng)證、劑量、療程等，以防不良反應(yīng)的發(fā)生。

1 江蘇新醫(yī)學(xué)院編.中藥大辭典〔M〕.上海:科學(xué)技術(shù)出版社，1977:1977.

2 廣西壯族自治區(qū)革命委員會衛(wèi)生管理服務(wù)站編.廣西中草藥第二冊〔M〕.廣西人民出版社，1970:228.

3 徐叔云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學(xué)〔M〕.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:882-3，886-7，911-3.

4 陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:23，232，305-7，364.

5 黃繼漢，黃曉暉，陳志揚，等.藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算〔J〕.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004;9(9):1069-72.

6 常菲菲，王友群.馬兜鈴酸體內(nèi)毒性的產(chǎn)生及防治研究進(jìn)展〔J〕.藥學(xué)進(jìn)展，2010;34(3):117-24.