多西紫杉醇對乳腺癌干細胞的作用研究

錢鈞強,張霄蓓,馬 懿,郝曉甍,張 晟

實體腫瘤中存在一部分數(shù)量較少、成瘤能力特別強、分化程度極低的細胞,稱為 “腫瘤啟動細胞 (tumor initiating cells)”、“成瘤性癌細胞 (tumorigenic cells)”或 “癌干細胞(cancer stem cells)”。癌干細胞具有類似于成體干細胞的特性:自我更新能力,多項分化潛能以及強大的體內(nèi)成瘤能力[1-2]。這些干細胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,同時也是腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移的罪魁禍首,這使得針對癌干細胞的研究成為腫瘤研究的重中之重[3-4]。研究證明,乳腺癌同樣存在著干細胞[5]。隨著實驗技術(shù)和條件的改善,特異性表型乳腺癌干細胞已可從癌細胞中分離,且其成瘤性已得到充分的證實,為乳腺癌干細胞的研究打下了堅實的基礎(chǔ)[5-6]。

多西紫杉醇現(xiàn)廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤的治療中,已經(jīng)成為乳腺癌患者的常規(guī)化學治療藥物之一。本實驗將分選出來的三種乳腺癌干細胞及未分類細胞分別置于含有不同濃度多西紫杉醇的培養(yǎng)液中,檢測多西紫杉醇對不同干細胞的生長抑制曲線,并利用流式細胞儀進行細胞周期及細胞凋亡的分析,從而明確該藥物對乳腺癌干細胞的作用及其機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 人乳腺癌細胞系 MCF-7、MDA-MB-231細胞株為本實驗室保存;在取得患者知情同意后,收集天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺癌標本 6例,經(jīng)病理確診均為浸潤性導管癌。

1.2 試劑 RPMI-1640、胎牛血清 (FBS)、Hank′s液、膠原酶、四甲基偶氮唑鹽 (MTT)、胰酶實驗耗材等購自 Gibco公司;熒光標記抗體購自 SANTA CRUZ生物科技公司;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自 KeyGEN公司;其他試劑均由天津市腫瘤醫(yī)院中心實驗室提供。

1.3 實驗儀器 流式細胞儀、酶聯(lián)免疫檢測儀、超凈臺、溫箱、離心機及其他實驗儀器均由天津市腫瘤醫(yī)院中心實驗室提供。

1.4 乳腺癌干細胞的獲得

1.4.1 原代乳腺癌干細胞的獲得 將新鮮的乳腺癌組織 (＞1 cm3)在無菌的條件下切碎至 1 mm3的組織塊;用現(xiàn)配的濃度為 1 mg/Ml膠原酶 (過濾無菌)在 37℃溫箱中消化 1～3 h,過濾后用 10%FBS-1640溶液重懸細胞,加入膠原涂抹的培養(yǎng)瓶中,置 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱保存過夜,用于第 2天流式細胞儀分選。分選前將細胞標記 CD44-APC、CD24-PE、ESA-FITC抗體,使用流式細胞儀分選出 CD+44、CD-/low24、ESA+的細胞,分選至培養(yǎng)瓶或 96孔板。

1.4.2 MCF-7、MDA-MB-231細胞系干細胞獲得 MCF-7、MDA-MB-231細胞系細胞均用 FBS-1640培養(yǎng)基、25 ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng),置于 37℃,5%CO2孵化箱中培養(yǎng)。每天換液,觀察細胞狀態(tài);待細胞數(shù)達到 108個時,將細胞消化,充分吹打成單細胞懸液。分選前將細胞標記 CD44-APC、CD24-PE、ESA-FITC抗體,使用流式細胞儀分選出 CD+44、CD-/low24、ESA+的細胞,分選至培養(yǎng)瓶或 96孔板。

1.5 干細胞培養(yǎng) 采用無血清的干細胞培養(yǎng)液:含1∶50 B27、20 ng/ml表皮生長因子 (EGF)、0.4%牛血清清蛋白、4μg/Ml胰島素的 DMEM∶F12(1∶1)培養(yǎng)液,防止乳腺癌干細胞的分化。

1.6 MTT試驗 將流式細胞儀分選出的干細胞置于已加入含不同終濃度藥物的干細胞培養(yǎng)液的 96孔板中,每一濃度設(shè) 5個復孔,于 37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h;給予不同濃度的多西紫杉醇孵育 24 h后,每孔加入 MTT 20μl(以PBS配成 5 mg/Ml),37℃,5%CO2的飽和濕度繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后中止培養(yǎng),吸棄上清,每孔加二甲亞砜 (DMSO)150μl,震蕩 10min。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值 (OD值),并繪制藥物作用曲線。應(yīng)用 SSPS 17.0的 probit軟件計算出藥物的半數(shù)抑制濃度 (IC50)。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化 將流式細胞儀分選出的 MDA-MB-231干細胞、原代乳腺癌干細胞置于盛有干細胞培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中,分 4組:(1)空白對照組 (Control組),(2)藥物作用 24 h組,(3)藥物作用 48 h組,(4)藥物作用 72 h組。多西紫杉醇作用濃度為 10μmol/L,空白對照組加入含 0.5%DMSO的培養(yǎng)液。處理結(jié)束后于 37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)所需時間,然后收集細胞。分別 Annexin-FITC(FITC熒光標記的膜聯(lián)蛋白)及 Propidium Iodide(PI,碘化丙啶),混勻;室溫下、避光孵育 5～15 min,1 h內(nèi)上機檢測細胞凋亡率,了解多西紫杉醇對干細胞凋亡的影響。

1.8 流式細胞儀檢測細胞周期 將流式細胞儀分選出的 MDA-MB-231干細胞、原代乳腺癌干細胞置于盛有干細胞培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中,分 4組:(1)空白對照組 (Control組),(2)藥物作用24 h組,(3)藥物作用48 h組,(4)藥物作用72 h組。藥物作用濃度為 10μmol/L,空白對照組加入含0.5%DMSO的培養(yǎng)液。處理結(jié)束后于 37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)所需檢測時間,然后收集細胞。以冰乙醇固定24 h,測試前去除乙醇,加入含有 RNA酶的 PI 500μl(1 mg/Ml)及 1m l PBS,4℃避光染 30～60 min。樣品上流式細胞儀,得到細胞各個時期的分布狀態(tài),計算出 G0/G1%、S%及G2/M%。了解細胞的周期分布及細胞的增殖活性。

2 結(jié)果

2.1 原代乳腺癌細胞、MCF-7、MDA-MB-231干細胞的比例 本研究利用近期醫(yī)學界公認的乳腺癌干細胞表型:CD+44、CD-/low24、ESA+,分別對原代乳腺癌細胞、MCF-7、MDA-MB-231進行干細胞的分選。其中原代乳腺癌干細胞僅占原代乳腺癌細胞總數(shù)的 (0.50±0.26)%;MCF-7中干細胞占 (1.40±0.26)%;MDA-MB-231細胞系中干細胞占(1.63±0.32)%(見圖 1)。

2.2 MTT試驗結(jié)果 多西紫杉醇作用的濃度梯度為:10 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L、 10μmol/L和 100 μmol/L。利用 SPSS 17.0軟件計算多西紫杉醇對各未分類細胞和干細胞的 IC50。相對于乳腺癌未分類細胞,各系乳腺癌干細胞均對多西紫杉醇存在一定的耐藥性:其中 MDA-MB-231未分類細胞 IC50為 34 nmol/L;而 MDA-MB-231干細胞 IC50為12.422μmol/L(P＜0.01);MCF-7細胞對多西紫杉醇的IC50為 31 nmol/L,分選出的干細胞為 8.357μmol/L(P＜0.01);對于原代干細胞而言,細胞系 IC50為 51 nmol/L,干細胞為 17.688μmol/L(P＜0.01)。從不同濃度的細胞生長抑制率可以看出,不論是癌細胞還是癌干細胞,多西紫杉醇對MCF-7細胞較為有效,MDA-MB-231次之,原代乳腺癌的效果最差 (見圖 2)。

圖 1 原代乳腺癌細胞 MCF-7及 MDA-MB-231的干細胞比例Figure 1 The proportion of CSCs in primary breast cancer cells,MCF-7 and MDA-MB-231

圖 2 不同濃度多西紫杉醇對乳腺癌干細胞生長抑制率的影響Figure 2 The inhibitory effectsof docetaxel in different concentrations on CSCs

2.3 多西紫杉醇對干細胞凋亡的影響 多西紫杉醇作用 24 h、48 h、72 h后,MDA-MB-231細胞總凋亡率分別為 (6.51±0.34)%、(7.61±0.33)%和 (8.01±0.08)%,均明顯高于對照組的 (1.43±0.09)%,差異有統(tǒng)計學意義 (F=428.586,P＜0.001),且干細胞早期凋亡率隨藥物作用時間的增加而升高,呈時間依賴性 (r=0.883,P=0.000)。然而,多西紫杉醇作用于乳腺癌原代干細胞時,相對于 0 h時(0.66±0.30)%的凋亡率,作用 24 h、48 h、72 h后可分別誘導 (1.05±0.14)%、 (2.18±0.11)%和 (2.46±0.35)%的干細胞出現(xiàn)早期凋亡,差異有統(tǒng)計學意義 (F=37.810,P＜0.001,見圖 3)。

2.4 多西紫杉醇對干細胞周期的影響 10μmol/L多西紫杉醇對 MDA-MB-231干細胞表現(xiàn)出一定的 G2/M期周期阻滯作用,24 h即達到,并且這種阻滯作用隨著時間的增加而增強 (r=0.970,P=0.000),其在 0 h、24 h、48 h、 72 h分別可誘導 (8.51±0.71)%、 (15.21±1.13)%、 (20.00±0.77)%和 (22.30±0.60)%的干細胞滯留在 G2/M期。原代乳腺癌干細胞也表現(xiàn)出相似的與作用時間相關(guān)的 G2/M期阻滯,但是程度要低 (r=0.982,P=0.000,見圖 4),其在 0 h、24 h、48 h、 72 h分別有 (8.47±0.46)%、 (11.77±0.68)%、(14.53±1.10)%和 (16.9±0.10)%的原代干細胞滯留在 G2/M期。

3 討論

3.1 原代乳腺癌及細胞系干細胞的含量 2003年 Al-Hajj等[6]借助異種乳腺癌細胞移植動物模型,第一次在實體瘤中分離和鑒定了腫瘤干細胞,證實了乳腺癌干細胞的存在。他們將乳腺癌術(shù)后標本中的腫瘤組織制成單細胞懸液,經(jīng)流式細胞儀篩選出具有特殊表面標志的細胞并注入免疫缺陷小鼠體內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有接種 ESA+、CD+44、CD-/low24、Lin-細胞的小鼠在12周內(nèi)均出現(xiàn)明顯的腫瘤,而該表型的細胞只需接種 1×103即能保證 100%成瘤 (是未分類細胞致瘤性的 50倍)。本研究就選取了 CD44、CD24、ESA三種標記物[7]作為乳腺癌干細胞特異性表面標記物進行進一步的實驗研究。本實驗首先對原代乳腺癌細胞、MCF-7及 MDA-MB-231進行干細胞的分選。結(jié)果顯示 MDA-MB-231中干細胞的比例最高,達 (1.63±0.32)%。這正與 Sheridan等[8]研究結(jié)果相符:表達 CD+44、CD-/low24的乳腺癌細胞的含量與乳腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),比例高的細胞系表達更高水平促侵襲相關(guān)基因,體外侵襲試驗提示侵襲能力更強。MDA-MB-231是三陰性乳腺癌細胞系[9],其易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及化療耐藥,這可能與其乳腺癌干細胞含有比例較高有關(guān)[9]。

3.2 乳腺癌干細胞的耐藥性 腫瘤干細胞因其腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體 G2(ABCG2)等三磷酸腺苷結(jié)合盒 (ATP binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運體的高表達,能將化療藥泵出,而對化療具有抵抗性[10]?；熕帤⑺懒苏即蠖鄶?shù)的分化細胞,而留下了少數(shù)的腫瘤干細胞,成為日后復發(fā)的根源。Liu等[11]將ESA+、CD+44、CD-/low24、Lin-的乳腺癌干細胞與正常乳腺上皮細胞進行差異表達分析,發(fā)現(xiàn) 186個基因的表達有顯著不同,將這些基因命名為 “侵襲性”基因信號 (IGS)。IGS的狀態(tài)對于乳腺癌患者是否存在遠處轉(zhuǎn)移、無病生存期、總生存期都具有指導性意義;且人乳腺癌原代細胞中的乳腺癌干細胞有更高水平的多藥耐藥基因 1(MDR1)表達和化療耐藥性,提示乳腺癌干細胞可以通過高表達 MDR1而逃逸化療。本實驗通過研究多西紫杉醇對原代乳腺癌及細胞系的未分類細胞與干細胞的不同影響發(fā)現(xiàn),不論是乳腺癌細胞系還是原代乳腺癌細胞,干細胞對多西紫杉醇均存在一定的耐藥性,需要加大藥物的作用濃度實現(xiàn)殺傷癌細胞的作用,從而進一步證實乳腺癌干細胞在乳腺癌化療中占有重要地位,它不但比其他乳腺癌細胞更容易在化療中發(fā)生治療逃逸,并且能夠通過變異獲得耐藥性,而化療后乳腺癌干細胞的自我更新加速將促進乳腺癌的復發(fā)。

圖 3 多西紫杉醇對乳腺癌干細胞凋亡的影響Figu re 3 Docetaxel enhances apoptosisof CSCs of primary breast cancer cells and MDA-MB-231

圖 4 多西紫杉醇對乳腺癌干細胞 G2/M期的影響Figure 4 Docetaxel induces G2/Mcell cycle arrest in CSCsof primary breast cancer cells and MDA-MB-231

3.3 多西紫杉醇對乳腺癌干細胞系的作用機制 研究中雖然發(fā)現(xiàn)了乳腺癌干細胞對多西紫杉醇具有一定的耐藥性,但是可以看出多西紫杉醇仍有抑制乳腺癌干細胞生長的作用。研究顯示,多西紫杉醇對乳腺癌干細胞生長的抑制作用隨藥物濃度的增高而增強,抑制率與藥物濃度成量效關(guān)系,其中多西紫杉醇對 ER+的乳腺癌細胞系 MCF-7干細胞最為有效 (IC50=8.357μmol/L)。多西紫杉醇主要作用在微管,微管是由微管蛋白聚合而成。微管蛋白則是由 α和 β兩個多肽亞單位所組成的分子量為 10萬 kDa的蛋白質(zhì)[12]。在微管蛋白的聚合作用和微管的解聚作用之間存在動態(tài)平衡,多西紫杉醇能加快微管蛋白聚合成微管的速度并延緩微管的解聚作用,從而形成穩(wěn)定的非功能性的微管束,使細胞被阻抑于細胞周期的 G2和 M時相,不能形成運動的紡錘體從而抑制有絲分裂和細胞增殖。多西紫杉醇的作用位點,主要作用于 β-微管蛋白的 N-末端 31位氨基酸和 217-231氨基酸殘基上,使具有可逆變化的微管不能解聚,阻止有絲分裂,最后導致癌細胞死亡[13-14]。本研究結(jié)果表明多西紫杉醇對 MDA-MB-231癌干細胞和原代乳腺癌干細胞表現(xiàn)出一定的 G2/M期周期阻滯作用,且隨著時間的延長,其對干細胞的 G2/M的阻滯率增加,故多西紫杉醇對乳腺癌干細胞周期的影響呈時間依賴性。細胞凋亡是由基因調(diào)控的主動死亡過程,是維持器官組織細胞數(shù)量穩(wěn)定和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機制。細胞凋亡調(diào)控失調(diào)是腫瘤組織過度生長的重要原因,促進細胞凋亡則有助于徹底治愈腫瘤[15]。10μmol/L多西紫杉醇與乳腺癌干細胞共孵育 48～72 h,可見凋亡細胞的典型形態(tài)學特征:早期表現(xiàn)為胞質(zhì)空泡化,繼而體積縮小,核染色質(zhì)固縮,核邊聚,染色質(zhì)斷裂,出芽,凋亡小體形成等。同時流式細胞儀檢測結(jié)果表明,隨著多西紫杉醇作用時間的增加,其凋亡率逐漸增高,呈時間依賴性。上述研究結(jié)果提示,多西紫杉醇可能通過誘導細胞凋亡而抑制乳腺癌干細胞增殖。

綜上所述,多西紫杉醇可在一定程度上抑制乳腺癌干細胞的生長,但同時存在一定的耐藥性。其抑制乳腺癌干細胞生長的機制可能與其加快微管蛋白聚合成微管的速度并延緩微管的解聚作用,使細胞被阻抑于細胞周期的 G2和 M時相有關(guān),使得干細胞有絲分裂和細胞增殖被抑制。此外,多西紫杉醇還可誘導乳腺癌干細胞早期凋亡,從而影響乳腺癌干細胞的增殖、黏附以及轉(zhuǎn)移能力,但其具體抗腫瘤作用機制仍需要進一步的研究完善。

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