低密度脂蛋白受體基因 I334V突變與高膽固醇血癥的相關(guān)性

張明明,帖彥青,霍麗靜,宋光耀

高膽固醇血癥是冠心病及其他動脈粥樣硬化性疾病的重要致病因素[1]。目前認為脂蛋白代謝相關(guān)酶或受體基因發(fā)生突變是引起膽固醇升高的主要原因,但具體機制目前尚未完全闡明。因此,了解患者膽固醇代謝相關(guān)的基因突變對于動脈粥樣硬化性心腦血管疾病的早期防治具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白受體 (LDL-R)缺陷是引起高膽固醇血癥的主要原因[2]。故本研究采用 PCR-RFLP方法對 LDL-R基因第 8外顯子的 I334V突變的基因頻率和基因型頻率進行了檢測,對I334V突變與血漿膽固醇水平的關(guān)系進行了探討,試圖為高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化的防治提供遺傳學(xué)的實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2008年12月—2009年 12月在我院體檢中心進行體檢的漢族人 1 390例,按照膽固醇水平分為 3組:(1)高膽固醇血癥組 620例,總膽固醇 (TC)≥6.22 mmol/L(240 mg/dl)和三酰甘油 (TG)＜1.7 mmol/L;其中男 350例,女 270例;平均年齡 (48.1±10.2)歲。 (2)邊緣高膽固醇血癥組 420例,5.18 mmol/L＜TC＜6.19 mmol/L(200 mg/dl＜TC＜239mg/d l)和 TG＜1.7 mmol/L;其中男 240例,女 180例;平均年齡 (48.6±9.6)歲。(3)正常對照組 350例,TC≤5.18 mmol/L(200 mg/dl),TG＜1.7 mmol/L,且低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C) ＜3.12 mmol/L;其中男 200例,女 150例;平均年齡 (48.3±9.5)歲。3組受檢者的性別、年齡間具有均衡性。血脂異常的診斷按照 《中國成人血脂異常防治指南》(2007)[3]的標(biāo)準(zhǔn)。3組受檢者均除外甲狀腺功能亢進癥、甲狀腺功能減退、慢性肝病、糖尿病、糖尿病腎病、腎病綜合征、腎移植術(shù)后等影響脂類代謝的疾病,排除應(yīng)用影響糖脂代謝藥物者。

1.2 方法

1.2.1 檢測指標(biāo) (1)一般指標(biāo):測量身高、體質(zhì)量、腰圍和血壓,計算體質(zhì)指數(shù) (BMI):BMI=體質(zhì)量 (kg)/身高2(m2)。(2)血脂測定:健康體檢人群過夜空腹 12 h,次日清晨抽取肘靜脈血 4ml置于促凝管中分離血清,待測血脂;另取 4 ml置于 EDTA抗凝管中,-80℃低溫冰箱中保存,用于提取 DNA。TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)采用酶法測定,采用 Beckman全自動生化分析儀檢測,LDL-C按 Friedwald公式計算:LDL-C=TC-(HDL-C+TG/2.2)。

1.2.2 LDL-R基因的多態(tài)性分析 (1)人基因組 DNA的提取:EDTA抗凝血 400μl按照天根 TIANamp Blood DNA Kit血液基因組 DNA提取試劑盒 (離心柱型)說明書提取基因組DNA。(2)PCR擴增 LDL-R基因目的片段:引物設(shè)計采用生物學(xué)軟件 Primer5.0,并與 Genebank進行比對。序列為:上游引物 5'-CCAAGCCTCTTTCTCTCTCTTCCAG-3',下游引物為 5'-CCACCCGCCGCCTTCCCGTGCTCAC-3';PCR反應(yīng)體系:共 20μl,包括:Gotaq Green Master Mix 10μl、上下游引物 2 μl、基因組 DNA 2μl、無核酶水 6μl。 PCR反應(yīng)采用降落聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù),具體條件見參考文獻[4]。(3)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析:PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶ClaⅠ進行酶切,反應(yīng)體系共 20μl,包括 PCR擴增產(chǎn)物 5μl,限制性內(nèi)切酶 1μl,Buffer 2μl以及雙蒸水。于37℃水浴酶切4 h,加入 loading buffer 2μl終止反應(yīng)。酶切產(chǎn)物經(jīng) 8%聚丙烯酰胺凝膠 (PAGE-Gel)電泳,100 mV,50m in,并與 Marker比較,用 UVPGDS-8000凝膠圖像分析系統(tǒng)鑒定,照相。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計檢驗。計量資料以 (±s)表示,多組間比較采用方差分析,基因頻率采用基因計數(shù)法計算;組間基因型與等位基因頻率比較采用χ2檢驗,危險因素分析采用單因素及多因素 Logistic回歸分析,以 P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組受檢者 BMI及血脂水平比較 高膽固醇血癥組、邊緣高膽固醇血癥組的 BMI高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。HDL-C水平在正常對照組、邊緣高膽固醇血癥組、高膽固醇血癥組依次降低,TC、LDL-C水平則依次升高,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05,見表1)。

2.2 LDL-R基因外顯子 8的 I334V突變的 PCR-RFLP分型

根據(jù)限制性內(nèi)切酶 Cla I的酶切情況,分為Ⅱ、Ⅳ、VV 3種基因型,LDL-R基因第 8外顯子擴增片段為 176 bp,如有Cla I酶切位點,得到 147 bp、29 bp兩條酶切片斷;如無該酶切位點,則僅得到一條 176 bp的擴增帶。因此,Ⅱ基因型存在 Cla I酶切位點,為 2條前移的電泳帶:147 bp、29 bp,IV基因型為 3條電泳帶:176 bp、147 bp、29 bp,VV基因型因突變 Cla I酶切位點消失,僅有一條 176 bp電泳帶 (見圖 1)。

2.3 3組受檢者LDL-R基因 I334V突變基因型構(gòu)成比與等位基因頻率的比較 高膽固醇血癥組 VV基因型頻率顯著高于邊緣高膽固醇血癥組及正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2值分別為 28.17和 24.50,P均 ＜0.01);且 V等位基因的頻率亦顯著高于邊緣高膽固醇血癥組及正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2值分別為 40.18和 44.15,P均 ＜0.01,見表 2)。

圖 1 LDL-R基因第 8外顯子 I334V突變的酶切電泳結(jié)果Figure 1 Electrophoretogram for Clal enzyme digestion in exon 8 of LDLR gene

表 1 高膽固醇血癥組、邊緣高膽固醇血癥組和對照組 B MI及血脂水平比較 (±s)Table 1 Comparison of BMIand serum lipid levels among the three groups

表 1 高膽固醇血癥組、邊緣高膽固醇血癥組和對照組 B MI及血脂水平比較 (±s)Table 1 Comparison of BMIand serum lipid levels among the three groups

注:BMI=體質(zhì)指數(shù),TC=總膽固醇,TG=三酰甘油,HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇,LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇;與正常對照組比較,*P＜0.05;與邊緣高膽固醇血癥組比較,△P＜0.05

組別 例數(shù) BMI(kg/m2) TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)正常對照組 350 25.1±2.2 3.96±0.47 1.03±0.29 1.49±0.31 2.24±0.36邊緣高膽固醇血癥組 420 27.4±2.9* 5.57±0.51* 0.99±0.30 1.26±0.32* 3.98±0.67*高膽固醇血癥組 620 26.4±2.4* 8.13±0.87*△ 1.05±0.32 0.98±0.27*△ 6.27±0.71*△F值.17 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 81.89 6 208.1 2.83 256.32 4 699

表 2 3組 LDL-R基因第 8外顯子 ClaI位點基因型和等位基因頻率分布 [n(%)]Table 2 Frequencies of genotype and allele of the ClaI site polymorphism in exon 8 of LDL-R gene among the three groups

2.4 受檢者 LDL-R基因 I334V突變基因型與血清脂質(zhì)水平的關(guān)系 在Ⅱ、Ⅳ及 VV基因型組中,TC、LDL-C水平有逐步上升的趨勢,組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。IV及 VV基因型組的 HDL-C水平顯著低于Ⅱ基因型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。TG、VLDL水平在 3組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05,見表 3)。

2.5 LDL-R基因 I334V突變不同性別間各基因型血脂水平的比較 將所有的受檢者按性別分組,然后對男性 (790例)、女性 (600例)各基因型血脂水平進行分析,結(jié)果顯示 TC、HDL-C和 LDL-C水平在不同基因型間差異仍然有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05,見表 4)。

表 3 LDL-R基因ClaI位點不同基因型血脂水平的比較 ( ±s,mmol/L)Tab le 3 Comparison of serum lipid levels among genotypes

表 3 LDL-R基因ClaI位點不同基因型血脂水平的比較 ( ±s,mmol/L)Tab le 3 Comparison of serum lipid levels among genotypes

注:VLDL=極低密度脂蛋白;與Ⅱ基因型組比較,*P＜0.05;與Ⅳ基因型組比較,△P＜0.05

基因型 例數(shù) TC TG HDL-C LDL-C VLDLⅡ 1 289 6.05±1.25 0.99±0.31 1.31±0.28 4.44±1.66 0.96±0.39Ⅳ 50 7.44±1.39* 1.02±0.29 1.17±0.23*6.03±1.68* 0.98±0.35 VV 51 9.92±2.48*△ 1.03±0.37 1.11±0.25*8.32±2.25*△ 1.01±0.51 F值.36 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＞0.05 119.10 0.38 3.40 102.04 2

表 4 不同性別間 L DL-R基因 I 334V突變 3 種基因型血脂水平的比較 ( ±s,mmol/L)Tab le 4 Comparison of serum lipid levels among different genotypes in different genders

表 4 不同性別間 L DL-R基因 I 334V突變 3 種基因型血脂水平的比較 ( ±s,mmol/L)Tab le 4 Comparison of serum lipid levels among different genotypes in different genders

注:與Ⅱ基因型組比較,*P＜0.05;與Ⅳ基因型組比較,△P＜0.05;與 VV基因型組比較,#P＜0.05

性別 基因型 例數(shù) TC TG HDL-C LDL-C VLDL男性 Ⅱ 730 6.06±1.36 0.98±0.31 1.22±0.24# 4.61±1.51 0.98±0.28 29 7.69±1.49* 0.96±0.28 1.20±0.18# 6.15±1.57* 1.01±0.23 VV 31 9.76±1.97*△ 0.96±0.30 1.08±0.28 8.40±1.75*△ 1.02±0.26 F值Ⅳ.76 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 135.8 0.10 3.31 95.77 0女性0.87±0.29Ⅳ21 7.09±1.57* 0.94±0.32 1.17±0.28# 5.57±1.51* 1.02±0.28 VV 20 10.17±2.05*△ 0.96±0.28 1.02±0.34 8.18±1.97*△ 0.98±0.26 F值Ⅱ559 5.63±1.50 0.92±0.27 1.29±0.34#△4.03±1.42.35 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 65.10 2.35 4.94 109.6 2

2.6 危險因素的 Logistic回歸分析 將 TC作為因變量,年齡、性別、BMI、基因型、TG、HDL-C作為自變量,進行單因素 Logistic回歸分析,發(fā)現(xiàn)年齡、TG、HDL-C、基因型有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);進一步以 TC作為因變量,年齡、基因型、TG、HDL-C作為自變量,行多因素 Logistic回歸分析,發(fā)現(xiàn)基因型是危險因素 [VV基因型可增加高膽固醇血癥的風(fēng)險,OR=3.161,95%CI(2.389,4.059)],HDL-C是保護性因素 [OR=0.543,95%CI(0.333,0.887)](見表 5)。

表 5 各危險因素的 Logistic回歸分析結(jié)果Table 5 Results ofmultiple logistic regression analysis

3 討論

膽固醇水平異常是動脈粥樣硬化和心腦血管疾病的重要危險因素。LDL-R的數(shù)量及功能對血漿膽固醇的含量起著至關(guān)重要的作用,LDL-R基因突變可引起 LDL-R結(jié)構(gòu)功能改變,循環(huán)中 LDL清除障礙,從而出現(xiàn)高膽固醇血癥、導(dǎo)致一系列心腦血管疾病[4]。近年來高膽固醇血癥的發(fā)生率逐年上升,且年輕化趨勢明顯,嚴重威脅人類健康。因此,高膽固醇血癥相關(guān)基因 LDL-R基因突變的研究也日益受到人們的重視。

LDL-R基因位于第 19號染色體短臂末端 (P13.1～13.3),全長 45 kb,分為 18個外顯子和 17個內(nèi)含子。LDLR基因存在多種基因多態(tài)性,本研究的 I334V突變是 LDL-R基因第 8外顯子中第 355位密碼子的第一個核苷酸 (第 1 063位堿基)由 A突變?yōu)?G,導(dǎo)致第 355位密碼子由 ATC變?yōu)镚TC,所編碼的氨基酸由異亮氨酸 (Ile)變?yōu)槔i氨酸 (Val),這是一個錯義突變 (1063A＞G,I334V),使原有的 ClaⅠ酶切位點消失。

本研究發(fā)現(xiàn) LDL-R基因 I334V突變與血清膽固醇水平的升高有著密切的聯(lián)系。1997年 Pimstone等[5]的研究發(fā)現(xiàn) I334V雜合子伴有中等程度升高的 TC水平、LDL-C水平以及 TC/HDL-C比值,說明 LDL-R基因突變與高膽固醇血癥有關(guān)。本研究通過 PCR-RFLP的方法首次發(fā)現(xiàn)了 I334V突變的純合子和雜合子,雜合子與純合子的 TC、LDL-C水平明顯高于無突變者,以純合子升高更為明顯,且 HDL-C的水平存在逐漸下降的趨勢。

本研究還發(fā)現(xiàn)高膽固醇血癥組的 I334V突變的 VV基因型及 V等位基因明顯高于邊緣高膽固醇血癥組和對照組,而且隨著Ⅱ、Ⅳ、VV基因型的變化,膽固醇的水平明顯升高,且以女性 VV基因型的膽固醇水平升高最為明顯,可能 VV基因型及 V等位基因與高膽固醇血癥尤其是女性高膽固醇血癥密切相關(guān),但這一結(jié)論尚待更大規(guī)模的研究予以證實,其機制也有待進一步探討。

回歸分析發(fā)現(xiàn) VV基因型是高膽固醇血癥的主要危險因素,HDL-C為保護性因素,表明 LDL-R基因第 8外顯子I334V突變可以影響血清膽固醇的水平,VV基因型是導(dǎo)致高膽固醇血癥獨立危險因素。

本研究證實 LDL-R基因的 I334V突變與血清膽固醇的水平關(guān)系密切,但目前僅進行了現(xiàn)象觀察,其中的具體機制尚待進一步研究。

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3 中國成人血脂異常防治指南制定聯(lián)合委員會.中國成人血脂異常防治指南 [J].中華心血管雜志,2007,359(5):390-409.

4 夏軍輝,王綠婭,藺潔,等 .家族性高膽固醇血癥并冠心病低密度脂蛋白受體基因突變分析 [J].實用兒科臨床雜志,2008,23(1):25-27.

5 Pimstone SN,Defesche JC,Clee SM,etal.Differences in the phenotype between children with fam iliar defective apolipoprotein B-100 and familiar hypercholesterolemia[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1997,17(5):826-833.

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低密度脂蛋白受體 (low density lipoprotein receptor,LDL-R)基因為一管家基因,分離并經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為5.3 Kb。在 LDL-R基因的任何部位出現(xiàn)異常都可致病?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 150多種 LDL-R基因異常,但 90%以上的改變都不很大,只不過是一個或幾個堿基發(fā)生異常而已。

LDL-R功能缺陷是引起高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化 (AS)的主要原因之一。近幾年來的研究發(fā)現(xiàn),不僅家族性高膽固醇血癥 (FH)是由于 LDL-R功能缺陷造成的,而且許多非家族性高膽固醇血癥也可發(fā)生 LDL-R數(shù)量不足、程度不同的功能損傷,導(dǎo)致血漿中低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)水平升高,形成 AS,這種 LDL-R的功能改變是由于輕微的遺傳缺陷與環(huán)境因素綜合引起的。因此,LDL-R功能缺陷受到越來越多的關(guān)注,其診斷和治療的研究已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的一個熱點。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,一些檢測 LDL-R mRNA的方法相繼出現(xiàn),對 LDL-R基因表達水平與調(diào)控水平在 AS及冠心病中作用的認識不斷深化,一些旨在增強LDL-R基因表達以降低血膽固醇水平的藥物相繼問世,高膽固醇血癥的治療已從過去的單純對癥治療發(fā)展到增強受體活性及基因替代療法。