測(cè)定維生素A含量的兩種方法比較

黃成安　張喜金　李斌

[摘要] 目的 通過(guò)比較測(cè)定維生素A含量的兩種不同方法，為維生素A及其制劑的含量測(cè)定提供參考，從而建立一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法。 方法 均采用高效液相色譜法測(cè)定，沸水浴回流皂化法采用甲醇-水（94∶6）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm，色譜柱溫度為40℃；加熱超聲法采用甲醇-水（98∶2）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為325nm，色譜柱溫度為40℃。 結(jié)果 通過(guò)檢測(cè)，兩種方法所得出的含量相差較小，相對(duì)誤差均在1.0%之內(nèi)。 結(jié)論 兩種測(cè)定方法均科學(xué)有效，能對(duì)湯臣倍健維生素A維生素D軟膠囊（兒童型）中維生素A的含量起到質(zhì)量控制的目的。方法2更為快捷簡(jiǎn)單，溶劑使用量少，能夠節(jié)省檢驗(yàn)成本，提高人員利用率。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜法；維生素A；方法比較

[中圖分類(lèi)號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）01-103-04

[Abstract] Objective Through the comparison of two different methods for the determination of vitamin A content，provides the reference for the content determination of vitamin A and its preparation，and to establish a rapid，accurate，simple detection method. Methods All by HPLC，using methanol water boiling water bath reflux saponification method （94：6） as mobile phase，the detection wavelength was 300nm，column temperature was 40℃；using methanol water heating and ultrasonic method （98：2） as mobile phase，the detection wavelength was 325nm，column temperature was 40℃. Results By detecting the content of two kinds of methods，the less difference，relative error is within 1%. Conclusion Two analysis methods are scientific and effective，vitamin A vitamin D soft capsules（for children） content of vitamin A to the purpose of quality control. Methods 2 is more simple，less solvent consumption，can save the test cost，improve the utilization rate.

[Key words] HPLC；Vitamin A；Comparison of methods

維生素A（圖1）可促進(jìn)視覺(jué)細(xì)胞內(nèi)感光色素的形成，調(diào)試眼睛適應(yīng)外界光線強(qiáng)弱的能力，以降低夜盲癥和視力減退的發(fā)生，維持正常的視覺(jué)反應(yīng)。而維生素A攝入過(guò)量也會(huì)引起副作用，可損害腦組織等，因此維生素A制劑含量的控制十分重要[1-3]。由于維生素A的不穩(wěn)定性，放置不當(dāng)或放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)均易導(dǎo)致其變質(zhì)，故選擇一種快捷簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠、專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高、成本低廉的測(cè)定方法，顯得尤為重要[4-5]。

維生素A在分類(lèi)中屬于脂溶性維生素，能夠調(diào)節(jié)人體的多種生理機(jī)能，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，在調(diào)節(jié)體內(nèi)各方面的代謝及促進(jìn)骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育上有著極其重要的作用，同時(shí)它也參與視網(wǎng)膜視紫質(zhì)的合成與再生，維持正常視覺(jué)[6-7]。維生素A主要存在于動(dòng)物肝臟、血液和眼球的視網(wǎng)膜中，又叫視黃醇。為黃至帶紅色的橙黃色液體，冷凍后可固化，有異臭，耐光和耐氧性弱，易被脂肪氧化酶分解[8-9]。不溶于水和甘油，混溶于氯仿、乙醚和脂肪。

1 儀器、對(duì)照品與試劑

維生素A醋酸酯對(duì)照品（DR，30112，純度：98.8%）；維生素A視黃醇對(duì)照品（SIGMA，BCBG2044V，純度：98%）；甲醇（AR級(jí)）；95%乙醇（AR級(jí)）；乙醚（AR級(jí)）；氫氧化鉀（AR級(jí)）；抗壞血酸（AR級(jí)）；甲醇（HPLC級(jí)）；蒸餾水。

超聲波清洗器（EQ-500）；高效液相色譜儀（島津-15C）；TB-215D型電子分析天平；AL-204型電子分析天平；EMS-50型磁力攪拌水浴鍋；R-202旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

2 結(jié)果

2.1 方法1

色譜條件：色譜柱：CNW Athena C18-WP（5μm，150mm×4.6mm）；以甲醇-水（94：6）為流動(dòng)相；流速為1.0mL/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為300nm。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取維生素A對(duì)照品5.67mg至50mL容量瓶，并用95%乙醇溶解定容至50mL，搖勻即得，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備母液。精密稱取芘內(nèi)標(biāo)物32.18mg至500mL容量瓶，并用95%乙醇溶解定容至刻度，搖勻即得內(nèi)標(biāo)溶液。精密量取1mL維生素A視黃醇對(duì)照品儲(chǔ)備母液至50mL容量瓶，加95%乙醇溶解并定容，以95%乙醇為空白，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。按C=A/1835÷100×1 000 000計(jì)算，其中C是濃度（單位為μg/mL），A是平均吸光度，1835是吸光系數(shù)，100是%系數(shù)轉(zhuǎn)換因子，1 000 000是單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、5mL置于25mL容量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液3mL，用95%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得5個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液，濃度為2.00272μg/mL，4.00544μg/mL，8.01088μg/mL，12.01632μg/mL，20.02720μg/mL。

供試品溶液的制備 取3個(gè)不同批號(hào)的湯臣倍健維生素A維生素D軟膠囊（兒童型），分別編號(hào)為1、2、3。各取20粒樣品，擠出內(nèi)容物，攪拌均勻后精密稱取試樣約0.075g于250mL三角瓶中，用95%乙醇約50mL使其溶解，直到顆粒物分散均勻?yàn)橹?。加?0%抗壞血酸水溶液5mL、3mL芘內(nèi)標(biāo)液、10mL氫氧化鉀水溶液（1∶1），混勻。于沸水浴回流60min使皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷卻。用50mL的水分兩次將皂化液全部轉(zhuǎn)入500mL分液漏斗中，加入100mL乙醚，輕輕搖動(dòng)，排氣后蓋好瓶塞，室溫下振蕩約10min后靜置分層，將水相轉(zhuǎn)入另一500mL分液漏斗中，按上述方法進(jìn)行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通過(guò)無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾脫水，濾液收入500mL圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上在（50±2）℃充氮條件下蒸至近干（絕不允許蒸干）。殘?jiān)芗尤?5%乙醇25mL，超聲波提取溶解，過(guò)濾，即得。

2.1.1 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按上述色譜條件測(cè)定。

2.2 方法2

2.2.1 色譜條件 色譜柱：ACCHROM Unitary C18（2.8μm，150mm×4.6mm）；以甲醇-水（98：2）為流動(dòng)相；流速為1.0mL/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為325nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取維生素A醋酸酯對(duì)照品5.51mg到50mL容量瓶中，加適量甲醇，超聲使其溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備母液。精確量取5mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備母液到50mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45μm的濾膜，即得。

2.2.3供試品溶液的制備 分別取編號(hào)為1、2、3的樣品，擠出內(nèi)容物，攪拌均勻后精密稱取試樣約0.55g置于25mL容量瓶中，加甲醇適量，于50～55℃超聲，并不時(shí)振搖樣品，30min后取出，冷卻，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45μm的濾膜，即得。

2.2.4 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液2μL、5μL、10μL、25μL、40μL與供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按上述色譜條件測(cè)定，所測(cè)峰面積見(jiàn)表3。

經(jīng)檢測(cè)，兩種方法得出的含量均在規(guī)定范圍之內(nèi)（50.00～83.25mg/100g），方法1為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.82-2003所使用的方法，通過(guò)驗(yàn)證兩種不同的檢驗(yàn)方法，所測(cè)出的維生素A的含量相差較小，相對(duì)誤差均在1.0%之內(nèi)，證明兩種測(cè)定方法均科學(xué)有效，能對(duì)湯臣倍健維生素A維生素D軟膠囊（兒童型）中維生素A的含量起到質(zhì)量控制的目的。而方法2的對(duì)照品配制方法、樣品處理方法更為快捷簡(jiǎn)單，耗用時(shí)間短，溶劑使用量少，能夠節(jié)省檢驗(yàn)成本，提高人員利用率，更為適合本企業(yè)。

3 討論

由于維生素A性質(zhì)不穩(wěn)定，分析時(shí)間長(zhǎng)會(huì)造成維生素A分解，故應(yīng)盡量縮短分析時(shí)間。經(jīng)過(guò)紫外光譜測(cè)定，在該色譜條件下，維生素A在325nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此方法2中選擇325nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)；流動(dòng)相中甲醇與水的比例經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，當(dāng)比例為（94∶6）時(shí)樣品中維生素A與內(nèi)標(biāo)物的分離較好，且維生素A保留時(shí)間適中，故方法1選用該比例進(jìn)行測(cè)定；在方法1中，當(dāng)使用乙醚進(jìn)行萃取后靜置，有部分樣品會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。當(dāng)出現(xiàn)該現(xiàn)象時(shí)，往分液漏斗中加入適量純化水或者95%乙醇，即可消除該現(xiàn)象。

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（收稿日期：2014-10-21）