三黃片專屬性近紅外定量分析模型的建立初探

徐東來， 莫 迎

(南寧食品藥品檢驗所，廣西南寧450001)

三黃片由大黃、鹽酸小檗堿、黃芩浸膏組成，具有清熱解毒，瀉火通便的功效。主要用于三焦熱盛所至的目赤腫痛、口鼻生瘡、咽喉腫痛、牙齦腫痛、心煩口渴、尿黃、便秘;急性胃腸炎，痢疾等［1］。其主要有效成分之一的鹽酸小檗堿，其測定方法是按《藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件匯編》(2003年 －2008年)［2］的 HPLC 進行測定，該方法需要一系列的樣品前處理工作、大量的試劑和熟練的操作人員。近紅外漫反射光譜法不需要對樣品進行破壞、不用試劑、不污染環(huán)境，分析速度快，結(jié)果準確，操作技術(shù)要求低［3］10，近兩年來近紅外漫反射光譜法已廣泛地應(yīng)用到藥品檢測車上對藥品進行初篩，本實驗以HPLC為參比方法，首次用近紅外漫反射法測定9家不同企業(yè)的樣品，建立了測定三黃片中鹽酸小檗堿含量的專屬性校正模型，對應(yīng)用NIR法進行中成藥快速分析的可能性進行了初步探討。

1 儀器

Matrix-F型傅立葉變換近紅外光譜儀(德國BRUKER公司)。

2 樣品

52批三黃片為2008年與2009年南寧食品藥品檢驗所監(jiān)督抽驗樣品。

3 實驗方法

3.1 三黃片中鹽酸小檗堿的含量 按《藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件匯編》(2003年－2008年)［2］的HPLC進行測定，以三黃片單位片重(mg)中所含的鹽酸小檗堿質(zhì)量(mg)表征三黃片的含量(%)。

3.2 NIR光譜采集 取樣品，磨去外層的糖衣層，用光纖探頭直接抵住片劑已除去糖衣的部位掃描，以儀器內(nèi)置背景為參比，掃描波長范圍為12 000～4 000 cm－1，分辨率為 8 cm－1，掃描次數(shù)為 64 次;每批樣品隨機抽取6片，每片按上述儀器參數(shù)測定1次，對每批樣品計算平均光譜。

3.3 訓(xùn)練集樣本 選取6個企業(yè)的36批編號為01、02、03、04、05、06、07、08、10、11、12、13、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27、29、36、37、38、39、41、42、44、45、46、48、49、50、52 的樣品作為訓(xùn)練集，含鹽酸小檗堿的純度范圍從0.713 3%～2.188 0%。

3.4 驗證集樣本 選取3個企業(yè)16批編號為09、14、15、16、23、28、30、31、32、33、34、35、40、43、47、51的樣本作為驗證集，含鹽酸小檗堿的純度范圍從0.833 1% ～2.065 8%。

對訓(xùn)練集樣品光譜數(shù)據(jù)用矢量歸一化(Vector Normalization)進行預(yù)處理，運用偏最小二乘法(PLS)建立校正模型［3］44-46。所有數(shù)據(jù)處理均使用儀器自帶的OPUS 5.0軟件進行。

4 結(jié)果與討論

4.1 近紅外模型的建立 比較三黃片、鹽酸小檗堿片(作為對照品)的原始NIRDRS光譜圖(見圖1)可知，由于所含鹽酸小檗堿的濃度不同，因此，選取差異性大的特定譜段、適當?shù)墓庾V預(yù)處理方法及合理的化學(xué)計量學(xué)方法以突出活性成分的信息是建立三黃片專屬性NIR定量模型的關(guān)鍵。

圖1 鹽酸小檗堿片(1)、52個三黃片樣品(2)的原始NIR光譜Fig.1 NIR spectra of berberine hydrochloride tablets(1)，52 batches of samples of Sanhuang Tablets(2)

4.1.1 訓(xùn)練集樣本的選擇 本文將收集到的9家生產(chǎn)企業(yè)52個三黃片市售樣本的近紅外光譜圖進行聚類分析(預(yù)處理方法:一階導(dǎo)數(shù)－矢量歸一;譜區(qū)范圍:12 000～4 000 cm－1)(見圖2)，在 0.28處可將全部樣本分為9大類，從每大類中分別取出2～4樣本共計36個樣本組成訓(xùn)練集，純度范圍為0.713 3%～2.188 0%，用于建立模型;剩余的 16個樣本組成驗證集，純度范圍為0.833 1% ～2.065 8%，用于模型的預(yù)測。

4.1.2 建立NIR模型 采用PLS法，利用OPUS軟件Quant-2中的所有的預(yù)處理方法并應(yīng)用其提供的自動優(yōu)化模型功能(Optimize)，比較內(nèi)部交叉驗證均方差(RMSECV)、外部驗證均方差(RMSEP)和決定系數(shù)的大小，自動進行光譜范圍及預(yù)處理方法的選擇;由NIR光譜(見圖1)可知，在5 400～6 800 cm－1范圍內(nèi)光譜吸收度的變化與樣品濃度的變化呈對應(yīng)關(guān)系;避開淀粉和硬脂酸鎂(8 100～9 000 cm－1和4 500～5 500 cm－1)、水分(7 450～7 100 cm－1和5 600～5 100 cm－1)及部分輔料如滑石粉(在 7 200 cm－1附近有尖峰)的干擾［4］，最終選擇 2個較好的校正模型列于表1;由于模型1的內(nèi)部交叉驗證均方差(RMSECV)、外部驗證均方差(RMSEP)為最小，且決定系數(shù)最接近100，因此，綜上所述，認為光譜的預(yù)處理方法為矢量歸一化、建模譜段為6 402.9～5 596.8 cm－1的校正模型1為最理想的模型。

4.2 近紅外模型的驗證

4.2.1 線性關(guān)系考察 在0.713 3%～2.188 0%的純度范圍內(nèi)，以NIR預(yù)測值(Y)和HPLC測定值(X)求得線性方程為:Y=0.983 2X+0.026 7，r=0.991 6。其內(nèi)部驗證相關(guān)性見圖3。

4.2.2 模型的可靠性和準確性 用模型1對驗證集中16個樣品的鹽酸小檗堿的含量進行預(yù)測，以考察模型的可靠性和準確性。外部驗證均方差(RMSEP)為0.127，決定系數(shù)為92.41。預(yù)測結(jié)果見表2，以NIR預(yù)測值與HPLC測定值的比值計算回收率，平均回收率為100.7%，RSD為5.63%(n=16)。

表1 三黃片中鹽酸小檗堿的含量測定校正模型Tab.1 The calibration model for determination of the contents of berberine hydrochloride of Sanhuang Tablets

圖3 三黃片HPLC測定結(jié)果與NIR自我訓(xùn)練測試結(jié)果相關(guān)性圖Fig.3 The HPLC(abscissa)and NIR calibration(ordinate)relativity grape of the contents(%)of Sanhuang Tablets

表2中NIR預(yù)測結(jié)果與HPLC測定值之間所建立的回歸方程為 Y=1.001 3X +0.010 7，r=0.967 3。因此可以認為該模型1可靠。NIR預(yù)測值與HPLC測定值對應(yīng)關(guān)系見圖4。

4.2.3 重復(fù)性 選取建模樣品中其中一批樣品，隨機取6片，按前述測定方法掃描NIR圖譜，每片掃1次，取6次的平均圖譜，重復(fù)10次，并利用所建模型測其鹽酸小檗堿的含量，測定結(jié)果的RSD為1.8%，可見該方法的重復(fù)性良好。

表2 模型對驗證集三黃片的預(yù)測結(jié)果Tab.2 The prediction results of validation sample

圖4 三黃片HPLC測定結(jié)果與NIR外部驗證測試結(jié)果相關(guān)性圖Fig.4 HPLC(abscissa)and NIR prediction(ordinate)relativity grape of the contents of Sanhuang Tablets

4.3 在快檢工作中的實際應(yīng)用

4.3.1 通用性模型具有涵蓋面廣，代表性強等優(yōu)點，作者曾經(jīng)對其建立過通用性模型，但是準確性較差，本實驗是根據(jù)轄區(qū)藥品質(zhì)量狀況針對9家生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的藥品所建立的具有地方特色的專屬性模型，其針對性強，準確性較高，在藥品檢測車的實際應(yīng)用中起到了一定的初篩效果。

4.3.2 在實際檢測操作中應(yīng)注意，一是判斷每批樣品結(jié)果時，將平均光譜與6張光譜的測得值綜合起來判斷，其初篩的效果會更好;二是在磨片除去糖衣時，應(yīng)按正反時針反復(fù)操作，以被磨處的表面平整、光滑、不殘留糖衣為佳。

5 結(jié)論

本實驗采用偏最小二乘法(PLS)，針對幾家特定的藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的藥品，建立了三黃片專屬性近紅外定量分析模型，該方法快速、簡便，具有一定的專屬性，可用于藥品檢測車的現(xiàn)場快速分析，以提高抽驗不合格藥品的靶向命中率，充分發(fā)揮近紅外儀在藥品監(jiān)督抽驗中的作用。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:328.

［2］國家食品藥品監(jiān)督管理局稽查局.藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件匯編(2003～2008年)［S］.2009:145-146.

［3］陸婉珍主編.現(xiàn)代近紅外光譜分析技術(shù)［M］.第2版.北京:中國石化出版社，2006.

［4］劉緒平，馮艷春，胡昌勤，等.頭孢拉定膠囊劑通用性近紅外定量分析模型的建立［J］.藥物分析雜志，2008，28(5):724.