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    內質網應激對3T3-L1脂肪細胞成纖維細胞生長因子21 mRNA表達的調節(jié)作用

    2014-11-01 07:05:34萬曉珊劉彥隆張翼肖業(yè)臣張海淼許竹梅肖健
    中國醫(yī)藥生物技術 2014年6期
    關鍵詞:內質網纖維細胞生長因子

    萬曉珊,劉彥隆,張翼,肖業(yè)臣,張海淼,許竹梅,肖健

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    內質網應激對3T3-L1脂肪細胞成纖維細胞生長因子21 mRNA表達的調節(jié)作用

    萬曉珊,劉彥隆,張翼,肖業(yè)臣,張海淼,許竹梅,肖健

    325035 溫州醫(yī)科大學藥學院(萬曉珊、劉彥隆、張翼、肖業(yè)臣、許竹梅、肖?。?30075 武漢華大醫(yī)學檢驗所有限公司(張海淼)

    在 mRNA 水平探討內質網應激對 3T3-L1 脂肪細胞成纖維細胞生長因子 21 表達的影響。

    利用經典雞尾酒法誘導 3T3-L1 前脂肪細胞分化,再用毒胡蘿卜內酯分別按照劑量梯度(0、6.25、12.5、25、50 和 100 nmol/L)和時間梯度(0、1、3、6 和 12 h)進行處理,實時 PCR 檢測內質網應激相關蛋白C/EBP 同源蛋白和葡萄糖調節(jié)蛋白 78 以及成纖維細胞生長因子 21 mRNA 的表達水平。

    毒胡蘿卜內酯能誘導分化成熟的 3T3-L1 脂肪細胞發(fā)生內質網應激,促進 C/EBP 同源蛋白、葡萄糖調節(jié)蛋白 78 和成纖維細胞生長因子 21 mRNA 水平顯著升高,且與毒胡蘿卜內酯的劑量和處理時間呈正相關。當用 100 nmol/L毒胡蘿卜內酯處理 6 h 后,成纖維細胞生長因子 21 mRNA 水平顯著增高,為對照組的 114.55 倍(< 0.05)。蛋白激酶C 抑制劑鈣磷酸蛋白 C 能阻斷由毒胡蘿卜內酯誘導的內質網應激,并伴隨成纖維細胞生長因子 21 mRNA 水平的下降。

    內質網應激能上調 3T3-L1 脂肪細胞成纖維細胞生長因子 21 mRNA 表達,且可被蛋白激酶C 抑制劑鈣磷酸蛋白C 阻斷。

    內質網應激; 3T3-L1 細胞; 成纖維細胞生長因子 21

    成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)家族共有 22 個成員,分為 7 個亞家族,其主要功能涉及胚胎發(fā)育、細胞增殖、組織修復和腫瘤發(fā)生等[1-3]。2000年,Nishimura 等[4]首次從小鼠胚胎中分離得到 FGF21。研究發(fā)現,FGF21 是 FGF 家族中的一個非典型性成員,其主要生物學功能是調節(jié)糖脂代謝[5-8]。

    目前認為,FGF21 主要在肝臟中表達,白色脂肪組織、胸腺、骨骼肌及胰島 β 細胞中也有少量表達[5,9-10]。臨床報告顯示,非酒精性脂肪肝、2 型糖尿病和肥胖等代謝疾病患者的血清 FGF21 水平顯著高于正常人群[11-13]。許多動物實驗也得到了類似的結果,與野生型小鼠相比,高脂飲食誘導的肥胖小鼠和遺傳型肥胖小鼠的血清 FGF21 水平明顯升高,且在肝臟和白色脂肪組織中,FGF21 mRNA 水平呈高表達[7, 14-16]。這些研究結果表明在糖尿病和肥胖等病理狀態(tài)下,FGF21 濃度“應激性”升高,提示這可能是一種反饋性調節(jié),但具體調控機制尚未闡明。

    內質網是真核細胞中一種重要的細胞器,是蛋白質合成、修飾的場所,參與糖類和脂類代謝,并維持細胞內鈣平衡。但當細胞受到缺氧、毒性藥物、感染等刺激時,內質網內未折疊蛋白聚集,鈣離子平衡失調,引起內質網應激,這是機體的一種代償性過程,對細胞有保護作用。大量研究報道,內質網應激與肥胖、胰島素抵抗和糖尿病等代謝疾病密切相關?,F已證實,肥胖可以引起肝臟和脂肪組織發(fā)生內質網應激[17-18],同時內質網應激也是觸發(fā)胰島素抵抗和 2 型糖尿病的核心機制[19-21]。

    然而,肥胖和糖尿病等代謝性疾病中 FGF21 的變化是否與內質網應激有關尚未見報道。本研究用毒胡蘿卜內酯(thapsigargin,TG)對已分化的脂肪細胞進行干預,建立內質網應激細胞模型,通過實時 PCR 檢測內質網應激信號分子葡萄糖調節(jié)蛋白 78(glucose regulated protein 78,GRP78)和 C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)及 FGF21 的表達水平,為探討代謝性疾病中 FGF21 的調控機制提供基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    小鼠前脂肪細胞株 3T3-L1 購于美國菌種保藏中心(ATCC);高糖 DMEM 培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、實時 PCR 試劑盒購于美國 Invitrogen 公司;重組人胰島素、地塞米松(dexamethasone,Dex)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(isobutyl methylxanthine,IBMX)和毒胡蘿卜內酯購于美國 Sigma 公司。

    1.2 方法

    1.2.1 小鼠 3T3-L1 脂肪細胞的培養(yǎng)和分化 用含 10% FBS 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)和維持 3T3-L1 前脂肪細胞,用經典雞尾酒法誘導其分化。當細胞長至接觸抑制 2 d 后,用分化液I(含 10 mg/L 胰島素、0.25 μmol/L Dex、0.5 mmol/L IBMX、10% FBS 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基)培養(yǎng)2 d,再用分化液II(含 10 mg/L 胰島素、10% FBS 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基)培養(yǎng) 2 d,之后用含 10% FBS 的高糖 DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每 2 天換液一次,分化8 ~ 9 d 后,分化率約為 90%,可用于下一步實驗。對分化成熟的 3T3-L1 細胞更換新鮮的完全培養(yǎng)基,然后用不同劑量 TG(0、6.25、12.5、25、50 和 100 nmol/L)處理 6 h 和用 100 nmol/L TG 處理不同時間(0、1、3、6 和12 h),以 DMSO 處理組作為對照,分別收集細胞,每組至少重復 3 次。

    用 250 nmol/L 蛋白激酶C 抑制劑鈣磷酸蛋白C 預處理已分化的 3T3-L1 脂肪細胞 2 h,然后用 100 nmol/L TG 處理 6 h,以未處理組作為對照,收集細胞,至少重復 3 次。

    1.2.2 實時 PCR 檢測 CHOP、GRP78 及 FGF21 的 mRNA 水平 用 Trizol 法提取總 RNA,260/280比值為 1.8 ~ 2.0,經逆轉錄反應合成 cDNA。然后利用 SYBR 熒光實時 PCR 法檢測 CHOP、GRP78 和 FGF21 mRNA 相對表達量。實驗所用引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。以 β-actin 為內參照基因,β-actin 引物序列:上游5' TGGAATCCTGTGGCATCCATGAA AC 3';下游5' TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTC CG 3'。CHOP 引物序列:上游5' GCATGAAGGAG AAGGAGCAG 3';下游5' CTTCCGGAGAGACAG ACAGG 3'。GRP78 引物序列:上游5' CAGATCTTCTCCACGGCTTC 3';下游5' GCAGGAGGAATTC CAGTCAG 3'。FGF21 引物序列:上游5' CTGGGG GTCTACCAAGCATA 3';下游5' CACCCAGGATT TGAATGACC 3'。反應體系為 10 μl,包含 Power SYBR Green PCR Master Mix 5 μl,上游引物 0.2 μl,下游引物 0.2 μl,cDNA 模板 0.5 μl,ddH2O 4.1 μl。反應條件:95 ℃預變性 5 min;95 ℃變性 30 s,58 ℃退火 45 s,40 個循環(huán)。每個樣本設 3 個復孔,同時設無模板陰性對照。

    1.3 統計學處理

    反應結束后,各個樣本的 Ct 值分別取平均數。以對照組的靶基因表達量為1,2-△△Ct即為實驗組相對對照組靶基因表達的倍數。

    2 結果

    2.1 不同濃度 TG 對 3T3-L1 脂肪細胞 FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 表達的影響

    分別用不同濃度 TG 處理 3T3-L1 脂肪細胞 6 h,以 DMSO 作為空白對照,用實時 PCR 檢測 FGF21、CHOP 和 GRP78 的 mRNA 表達水平。結果顯示,FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 水平隨著劑量的升高呈遞增趨勢(圖 1),當 TG 濃度為 100 nmol/L 時,FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA達到最高,具有顯著性差異(< 0.05)。

    2.2 TG 處理不同時間對 3T3-L1 脂肪細胞 FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 表達的影響

    100 nmol/L TG 處理 3T3-L1 脂肪細胞 1、3、6 和 12 h 后,收集細胞,實時 PCR 檢測 FGF21、CHOP 和 GRP78 的 mRNA 表達水平。如圖 2 所示,隨著處理時間的延長,FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 表達水平上升,6 h 時達到峰值,12 h 后逐漸降低。處理 6 h,FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 水平分別為對照組的 114.55、23.20和 12.33 倍,具有顯著性差異(< 0.05)。因此,在后面的實驗中我們選擇 100 nmol/L TG 處理 6 h 作為最佳處理條件。

    2.3 蛋白激酶C 抑制劑鈣磷酸蛋白 C 對 TG 誘導的內質網應激的影響

    250 nmol/L鈣磷酸蛋白 C 預處理 3T3-L1 脂肪細胞 2 h,然后再加入100 nmol/L TG 處理 6 h,收集細胞,實時 PCR 檢測 FGF21、CHOP 和GRP78 mRNA 的表達水平。如圖 3 所示,與對照組相比,TG 單獨處理組中,FGF21、CHOP 和GRP78 mRNA 水平顯著升高(< 0.05),這與前期實驗結果一致;與 TG 單獨處理組相比,鈣磷酸蛋白 C 預處理組中 FGF21、CHOP 和 GRP78 mRNA 水平顯著降低(< 0.05)。

    FGF21 mRNA 相對水平FGF21 mRNA fold changes150 100 50 0 CHOP mRNA 相對水平CHOP mRNA fold changes30 20 10 0 0 0.25 12.5 25 50 100 0 0.25 12.5 25 50 100 TG 濃度(nmol/L)TG concentration (nmol/L)A TG 濃度(nmol/L)TG concentration (nmol/L)B

    Figure 1 Effect of different doses of TG on mRNA levels of FGF21 (A), CHOP (B) and GRP78 (C) in the differentiated 3T3-L1 cells (*< 0.05)

    FGF21 mRNA 相對水平FGF21 mRNA fold changes150 100 50 0 CHOP mRNA 相對水平CHOP mRNA fold changes30 20 10 0 0 1 3 6 12 0 1 3 6 12 時間(h)Time (h)A 時間(h)Time (h)B

    Figure 2 Effect of TG on mRNA levels of FGF21 (A), CHOP (B) and GRP78 (C) after treatment for different time in the differentiated 3T3-L1 cells (*< 0.05)

    FGF21 mRNA 相對水平FGF21 mRNA fold changes150 100 50 0 CHOP mRNA 相對水平CHOP mRNA fold changes30 20 10 0 對照組 TG 鈣磷酸蛋白 C + TG Control Calphostin C + TGA 對照組 TG 鈣磷酸蛋白 C + TG Control Calphostin C + TGB

    Figure 3 Effect of PKC inhibitor on TG-induced mRNA levels in the differentiated 3T3-L1 cells (*< 0.05)

    3 討論

    FGF21 是一個與糖脂代謝有關的因子,臨床研究和動物實驗結果均顯示,肥胖和糖尿病等病理狀態(tài)下,FGF21 水平顯著升高,且與甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、胰島素等指標呈正相關,FGF21 的升高被認為是一種反饋性上調,但具體的分子機制未見報道。

    文獻報道,肥胖中脂質過量堆積、胞內能量流動和養(yǎng)分利用障礙會誘發(fā)內質網應激[17, 22],內質網應激激活的 IRE1α-JNK 信號通路會導致胰島素受體及其底物功能障礙,這是發(fā)生胰島素抵抗的重要原因[17, 23]。持續(xù)的胰島素抵抗會促使胰島素不斷合成和分泌,進而引起胰島 β 細胞的內質網發(fā)生代償性擴張,蛋白質合成增加,導致未成熟的蛋白質在內質網中積累,進一步加重內質網應激,最終使 β 細胞衰竭,引發(fā) 2 型糖尿病。由此可見,肥胖、胰島素抵抗和糖尿病中均存在不同程度的內質網應激,表明內質網應激與這些代謝疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。

    TG 是內質網膜 Ca2+-ATP 酶抑制劑,誘導胞漿內 Ca2+濃度上升和內質網儲存鈣的下降,從而引起內質網應激。本實驗應用 TG 處理體外分化培養(yǎng)的 3T3-L1 脂肪細胞,發(fā)現內質網應激的標志分子 GRP78 和 CHOP mRNA 水平隨 TG 濃度的增加和作用時間的延長而逐漸增高,表明成功構建了 3T3-L1 脂肪細胞內質網應激模型。同時,FGF21 的 mRNA 水平也隨著內質網應激加劇而升高。當用 100 nmol/L TG 處理 6 h 后,FGF21 的 mRNA 水平為對照組的 114.55 倍,與對照組有顯著性差異,但是 12 h 后,表達水平又有所下降,這可能是由于處理時間過長,TG 對細胞產生了一定的毒性。而與 TG 處理組相比,蛋白激酶C 抑制劑鈣磷酸蛋白 C 預處理阻斷了內質網應激,CHOP 和 GRP78 的 mRNA 水平顯著降低,同時伴隨 FGF21 mRNA 水平的降低。表明在分化的 3T3-L1脂肪細胞中,內質網應激上調了 FGF21 表達,提示在肥胖和糖尿病等代謝性疾病中 FGF21 水平的升高可能是由內質網應激引起的。同時,TG 是一種典型的 Ca2+釋放劑,而胞內高濃度 Ca2+會活化蛋白激酶C,我們推測 FGF21 的調控可能與 Ca2+介導的信號通路密切相關,具體機制有待進一步研究。

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    Effect of endoplasmic reticulum stress on FGF21 mRNA expression in the differentiated 3T3-L1 cells

    WAN Xiao-shan, LIU Yan-long, ZHANG Yi, XIAO Ye-chen, ZHANG Hai-miao, XU Zhu-mei, XIAO Jian

    To study the effect of endoplasmic reticulum stress on FGF21 expression in the differentiated 3T3-L1 cells.

    3T3-L1 pre-adipocytes were culturedand differentiated into adipocytes, and then treated with different concentrations of thapsigargin (TG) (0, 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 nmol/L) for 6 h or 100 nmol/L TG for different time (0, 1, 3, 6 and 12 h). The mRNA levels of CHOP, GRP78 and FGF21 were detected using real time PCR.

    TG-induced endoplasmic reticulum stress increased mRNA expression of CHOP,GRP78 and FGF21 in a dose- and time- dependent manner. FGF21 mRNA expression in 3T3-L1 adipocytes treated by 100 nmol/L TG for 6 h was significantly higher than that of control group (< 0.05). PKC inhibitor calphostin C markedly inhibited TG-induceed endoplasmic reticulum stress, and reduced FGF21 mRNA expression.

    FGF21 mRNA expression can be up-regulated by endoplasmic reticulum stress, which can be inhibited by PKC inhibitor calphostin C.

    Endoplasmic reticulum stress; 3T3-L1 cells; Fibroblast growth factor 21

    XU Zhu-mei, Email: profxzm2008@126.com

    10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.004

    國家自然科學基金(81170813、81300311);浙江省自然科學基金(Y2100048、LY12H03001、LQ13H280002);浙江省重點科技創(chuàng)新團隊項目(2010R50042)

    許竹梅,Email:profxzm2008@126.com

    2014-03-26

    Author Affiliations: School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China (WAN Xiao-shan, LIU Yan-long, ZHANG Yi, XIAO Ye-chen, XU Zhu-mei, XIAO Jian); BGI Wuhan, Wuhan 430075, China (ZHANG Hai-miao)

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