以蛋白激酶A為靶點(diǎn)的抗結(jié)核藥物高通量篩選模型的建立和應(yīng)用

羅睿，徐建，魏玉珍，李海龍，劉紅宇，蘇靜，趙莉莉，張玉琴，余利巖

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以蛋白激酶A為靶點(diǎn)的抗結(jié)核藥物高通量篩選模型的建立和應(yīng)用

羅睿，徐建，魏玉珍，李海龍，劉紅宇，蘇靜，趙莉莉，張玉琴，余利巖

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所藥用微生物菌種保藏管理中心

建立以蛋白激酶 A 為靶點(diǎn)的抗結(jié)核藥物高通量篩選模型，應(yīng)用該模型篩選具有特異性酶活抑制活性的微生物發(fā)酵液粗提物樣品。

以結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 基因組 DNA 為模板，擴(kuò)增目的基因片段，構(gòu)建表達(dá)載體 pET43.1a-，在大腸桿菌中克隆表達(dá)了重組 MTB PknA 蛋白；采用三步級(jí)聯(lián)的反應(yīng)方法，利用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸到氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸這一反應(yīng)最大吸光值波長(zhǎng)的變化，建立和優(yōu)化蛋白激酶A 抑制劑高通量藥物篩選模型。

成功構(gòu)建了表達(dá)載體 pET43.1a-；建立了穩(wěn)定靈敏，可用于靶向結(jié)核分枝桿菌蛋白激酶A 的抗結(jié)核藥物高通量篩選模型；利用該模型對(duì) 4000 個(gè)微生物發(fā)酵液粗提物樣品進(jìn)行篩選，最終得到 21 個(gè)抑制蛋白激酶A 活性的陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率 0.53%；以恥垢分枝桿菌和海分枝桿菌為檢定菌，平板紙片法檢測(cè)陽(yáng)性樣品的抗分枝桿菌活性，然后對(duì)陽(yáng)性樣品的細(xì)胞毒性和酶活抑制特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)后，最終得到 8 個(gè)陽(yáng)性樣品，其中 I10AA-02916、I09AA-02717、I09AB-02729、I08AB-00801 這 4 個(gè)陽(yáng)性樣品酶活抑制特異性、抗菌活性均較好，且細(xì)胞毒性較低。

建立了高穩(wěn)定性的以蛋白激酶A 為靶點(diǎn)的抗結(jié)核藥物高通量篩選模型，應(yīng)用該模型所得到的發(fā)酵液陽(yáng)性樣品值得進(jìn)一步研究。

環(huán)AMP依賴性蛋白激酶類； 藥物評(píng)價(jià)，臨床前； 抗結(jié)核藥； 高通量篩選

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌引起的嚴(yán)重危害人類健康、流行最廣的感染性疾病之一[1]。20 世紀(jì)初，人們?cè)欢葮酚^地估計(jì)，將在全球范圍內(nèi)消滅結(jié)核病。然而，結(jié)核病不僅沒有被消滅，反而在 20 世紀(jì)中后期卷土重來，并陸續(xù)產(chǎn)生多重耐藥、廣泛耐藥和超級(jí)耐藥結(jié)核分枝桿菌等變種[2-5]。據(jù) WHO 統(tǒng)計(jì)，2012 年全球新發(fā) 860 萬結(jié)核患者，并有 130 萬人死于結(jié)核病。結(jié)核病合并艾滋病的流行趨勢(shì)也是未來需要面對(duì)的挑戰(zhàn)[6-7]。因此，尋找能有效治療多重耐藥結(jié)核、廣泛耐藥結(jié)核等新型有效的抗結(jié)核藥物顯得尤為迫切。

蛋白激酶 A（protein kinase A，PknA）是結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的 11 種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinases，STPKs）之一，是結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)所必需的[8]。不僅影響結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞分裂和細(xì)胞壁合成，還可能干擾宿主細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)?；蛟谥笖?shù)生長(zhǎng)期顯著表達(dá)，過表達(dá) PknA 會(huì)降低生長(zhǎng)速度并改變細(xì)胞形態(tài)，而敲除基因的結(jié)核分枝桿菌菌體則變得細(xì)長(zhǎng)[9-11]。PknA 對(duì)結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)分裂和細(xì)胞形態(tài)的維持具有重要作用，同時(shí)，與人同源蛋白激酶（CK1）基因系列差異較大，相似性低于 30%[12]。因此，可作為理想的新型抗結(jié)核藥物篩選靶點(diǎn)，期望獲得選擇性較好的蛋白激酶抑制劑。

微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物有結(jié)構(gòu)新穎、多樣和低毒等特點(diǎn)，是新藥開發(fā)的重要資源之一，當(dāng)前天然產(chǎn)物來源的病原菌蛋白激酶抑制劑報(bào)道較少[13-14]。本研究通過建立以 PknA 為靶點(diǎn)的高通量篩選模型，期望在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中開發(fā)新型酶活抑制活性特異和抗菌活性均較好的抑制劑，為開發(fā)有效的抗耐藥結(jié)核分枝桿菌先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 大腸桿菌菌株 DH5α、BL21(λDE3)、恥垢分枝桿菌（mc2155，CPCC 203649）和海分枝桿菌（ATCC 927，CPCC 100246）以及用于微生物發(fā)酵液樣品制備的 2000 株藥物篩選菌株均保藏于國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)國(guó)家微生物資源平臺(tái)的藥用微生物資源子平臺(tái)；人巨噬細(xì)胞 THP-1、鼠巨噬細(xì)胞 Raw264.7 及原核表達(dá)載體pET43.1a(+) 為本所免疫室惠贈(zèng)；pMD?19-T 載體購(gòu)自日本 Takara 公司。

1.1.2 儀器和試劑 Pyrobest DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶均購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；?KTA 層析系統(tǒng)為美國(guó) GE Healthcare 公司產(chǎn)品；PolarFluostar 多功能熒光檢測(cè)儀為德國(guó) BMG 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核分枝桿菌基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá)

1.2.1.1基因的體外擴(kuò)增 利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 的基因組序列信息，獲取蛋白激酶 A 的序列，對(duì)該序列設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)囊?，上游?' CG（R I）ATGAGCCCCCG AGT 3'；下游：5' CCAA（d III）CGCTA TCTCGTATC 3'。以結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 基因組 DNA 為模板，PCR 反應(yīng)擴(kuò)增出目的基因片段。瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物，進(jìn)行膠回收純化，然后將目的片段進(jìn)行末端加 A 反應(yīng)。使用T4 DNA 連接酶將加尾的 PCR 產(chǎn)物與 pMD?19-T 載體在 16 ℃ 進(jìn)行連接，連接后的重組質(zhì)粒命名為 T-。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒雙酶切鑒定插入的片段，再測(cè)序驗(yàn)證序列的正確性。

1.2.1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 分別用R I和d III對(duì) T-和 pET43.1a 進(jìn)行雙酶切，獲得目的基因片段和線性化的 pET43.1a。用 T4 連接酶在 16 ℃連接6 ~ 8 h。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，然后涂布于含有 100 mg/L 氨芐西林的 LB 平板上。37 ℃培養(yǎng) 16 h 篩選重組子，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定載體的正確性，并測(cè)序驗(yàn)證片段及插入方向的正確性。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為 pET43.1a-。

1.2.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 用構(gòu)建好測(cè)序正確的 pET43.1a-質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(λDE3)，挑取轉(zhuǎn)化子在 100 mg/L 氨芐西林的 LB 液體培養(yǎng)基中 37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至600= 0.6 ~ 0.8，加入終濃度1 mmol/L 的 IPTG，20 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過夜誘導(dǎo)表達(dá)。12 h 后離心收獲菌體，稱量菌體濕重并裂解菌體細(xì)胞，通過 SDS-PAGE 蛋白電泳檢測(cè)目的蛋白在 BL21 中的表達(dá)。采用壓力破碎對(duì)菌體進(jìn)行破壁，裂解液于 4 ℃、12 000 r/min 離心40 min，取上清用 0.22 μm 濾膜過濾。采用 ?KTA 系統(tǒng)對(duì)過濾后的裂解液進(jìn)行蛋白的分離純化，以 5 ml HisTrapTMHP 鎳離子親和層析柱上樣，20 ~ 300 mmol/L 的洗脫緩沖液梯度洗脫目的蛋白，收集洗脫峰，對(duì)純化蛋白脫鹽和蛋白定量。加入蛋白保存液，檢測(cè)蛋白濃度后，分裝后于–80 ℃凍存。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌 PknA 活性的測(cè)定 由于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）在 340 nm波長(zhǎng)處有最大光吸收，而氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的最大光吸收在 260 nm 處。伴隨著 NADH 到 NAD+這一反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)體系在 340 nm 波長(zhǎng)下的光吸收值會(huì)大大降低，其數(shù)值可通過酶標(biāo)儀測(cè)得。因此本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)反應(yīng)體系在340 nm 波長(zhǎng)下的光吸收值變化來反映體系中 ADP的生成量，進(jìn)而反映出 PknA 的催化活性大小。酶活測(cè)定體系終濃度為：Hepes 100 mmol/L、MgCl210 mmol/L、MnCl22 mmol/L、ATP 2 mmol/L、PEP 1 mmol/L、NADH 1 mmol/L、PknA 9.5 μg/100 μl、丙酮酸激酶 1.8 U/100 μl、乳酸脫氫酶 1.8 U/100 μl。

1.2.4 結(jié)核分枝桿菌 PknA 抑制劑酶水平篩選模型的建立、優(yōu)化和應(yīng)用

1.2.4.1 篩選模型相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 考察篩選模型反應(yīng)體系中各組分對(duì)酶活性影響，確定最佳反應(yīng)條件，對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，以及對(duì)孔板的穩(wěn)定性、均一性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

模型評(píng)價(jià)指標(biāo)計(jì)算公式：

S=正常酶反應(yīng)體系熒光值 N其他成分熒光值平均值

其中 S/N：信噪比；max：最大平均值；min：最小平均值；max：最大標(biāo)準(zhǔn)差；min：最小標(biāo)準(zhǔn)差；n：孔數(shù)。

1.2.4.2 待測(cè)樣品的前處理 每個(gè)菌株均采用兩種培養(yǎng)基 A1 和 A2 進(jìn)行發(fā)酵[15]。從斜面上挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌種轉(zhuǎn)接入25 ml 發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、190 r/min 旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng) 4 d。微生物發(fā)酵液用等體積的丙酮抽提，離心后取 10 ml 的上清真空濃縮揮干，用1 ml DMSO 溶解得到粗提物。篩選時(shí)用等體積的DMSO 倍比稀釋，取 1 μl 加入至 100 μl 反應(yīng)體系。

1.2.4.3 待測(cè)樣品對(duì) PknA 抑制作用的測(cè)定 依照前文所述配制酶活測(cè)定反應(yīng)體系，并在每 100 μl 反應(yīng)體系中加入 1 μl 待測(cè)發(fā)酵液樣品。陽(yáng)性對(duì)照為不加 PknA（相當(dāng)于酶活性被完全抑制）的體系，陰性對(duì)照為以等體積的發(fā)酵培養(yǎng)基抽提液代替待測(cè)樣品（相當(dāng)于未加抑制劑）。

酶抑制率IR（%）=

(?mOD340/t)陰性對(duì)照– (?mOD340/t)樣品× 100% (?mOD340/t)陰性對(duì)照– (?mOD340/t)陽(yáng)性對(duì)照

1.2.4.4 假陽(yáng)性結(jié)果的排除 假陽(yáng)性排除體系：100 mmol/L Hepes、10 mmol/L MgCl2、2 mmol/L MnCl2、2 mmol/L ADP、1 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸、1 mmol/L NADH、1.8 U 丙酮酸激酶、1.8 U 乳酸脫氫酶，并加入待測(cè)樣品。酶標(biāo)儀 37 ℃下監(jiān)測(cè)上述反應(yīng)體系 5 min 內(nèi)340值的變化。若反應(yīng)體系的340值迅速降低，則表明模型篩得的陽(yáng)性樣品確實(shí)是 PknA 的抑制劑而非丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的抑制劑，否則即為假陽(yáng)性。

1.2.4.5 平板紙片法測(cè)定酶水平陽(yáng)性樣品的抗菌活性 分別采用恥垢分枝桿菌和海分枝桿菌作為檢定菌，建立簡(jiǎn)便、快速、有效的細(xì)胞水平篩選模型。將檢定菌按 1.0% 分別接種于7H11 培養(yǎng)基中，倒平板。將加有 20 μl 發(fā)酵液樣品的 6 mm 的紙片貼于平板上，分別培養(yǎng) 12 h 和 48 h 后測(cè)量抑菌圈的大小。采用異煙肼作為陽(yáng)性對(duì)照，濃度 100 μg/紙片。

1.2.4.6 MTT 比色法檢測(cè)陽(yáng)性樣品的細(xì)胞毒性 采用 MTT 法檢測(cè)篩選所得的陽(yáng)性樣品對(duì)人巨噬細(xì)胞 THP-1 和鼠巨噬細(xì)胞 Raw264.7 存活的影響情況[16]。加入的發(fā)酵液終濃度為 1%。細(xì)胞存活率計(jì)算式為：

細(xì)胞存活率（%）=OD加藥組– OD本底× 100% OD空白對(duì)照組– OD本底

1.2.4.7 NADH 比色法檢測(cè)陽(yáng)性樣品的酶活特異性 檢測(cè)陽(yáng)性樣品對(duì)其他兩個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 MTB 蛋白激酶 B（PknB）和 MTB 蛋白激酶 G（PknG），非絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 MTB 肽脫甲酰基酶（PDF）和 MTB 苯丙氨酰-tRNA 合成酶（PheRS）以及人蛋白激酶 B（AKT1）的酶活抑制率。初步驗(yàn)證陽(yáng)性樣品的酶活特異性。PknB、PknG、PDF、PheRS 酶活檢測(cè)步驟詳見參考文獻(xiàn)[17-20]。AKT1 酶活測(cè)定方法與 PknA 的酶活測(cè)定方法類似，體系濃度為：AKT1 2 μg/100 μl、ATP 1 mmol/L、NADH 1 mmol/L。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

2.1.1 重組質(zhì)粒 pET43.1a-的構(gòu)建 以結(jié)核桿菌 H37Rv 基因組 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增得到的 DNA 片段與A（1296 bp）基因片段大小相符。構(gòu)建A 基因的克隆載體并命名為 T-A。通過將基因片段和線性化的 pET43.1a 同時(shí)連接，獲得重組質(zhì)粒 pET43.1a-A。DNA 測(cè)序結(jié)果表明，基因序列和插入載體的方向正確（圖 1）。

bp 1 2 700055003500 2000 1000 500 pET-43.1a(+) pknA

Figure 1 Digestion analysis of pET 43.1a-by restriction enzymes

2.1.2 結(jié)核分枝桿菌重組 PknA 的表達(dá)和純化 將重組表達(dá)質(zhì)粒 pET43.1a-A 轉(zhuǎn)化BL21(λDE3) 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后，通過 4% ~ 12% 的梯度膠 SDS-PAGE 電泳檢測(cè)總蛋白，結(jié)果顯示結(jié)核分枝桿菌 Nus-PknA 融合蛋白得到了很好地表達(dá)，大小約 115 kD（圖 2）。SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果表明純化后的蛋白具有較高的純度，達(dá)95.60%。

2.2 結(jié)核分枝桿菌 PknA 的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

2.2.1 重組 PknA 蛋白比活力的測(cè)定 本研究把 37 ℃下，每分鐘催化 1 μmol/L 底物 ATP 生成產(chǎn)物 ADP 所需的 PknA 量定義為一個(gè)活力單位（U）。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組Δm340/t 值為 21.73，空白對(duì)照組 Δm340/t 值為 4.95（圖 3），每分鐘反應(yīng)的NADH 量為 9.58 μmol/L，即每分鐘反應(yīng)的 ATP 量為 9.58 μmol/L。反應(yīng)體系中加入的酶量為 9.5 μg，由此計(jì)算得到每 mg 重組 PknA 的比活力是 1008.4 U。

kD 1 2 3 4 5 210 105 785545 34 17 Nus-PknA

Figure 2 The purification of PknA expressed in

圖 3 PknA 催化反應(yīng)體系光吸收變化曲線

Figure 3 Experimental determination of the reaction rate

2.2.2 反應(yīng)速率與酶濃度的關(guān)系 本研究保持反應(yīng)體系中其他反應(yīng)物的濃度不變，分別測(cè)定PknA 在不同濃度下的反應(yīng)速率。結(jié)果表明，反應(yīng)速率隨著酶濃度的增加而逐漸加快，兩者呈良好的線性關(guān)系（圖4）。

2.2.3 重組 PknA 蛋白反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究 本研究中，PknA 催化反應(yīng)的底物為ATP。在固定其他底物濃度的條件下，分別設(shè)置一系列ATP 濃度，研究其酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。研究結(jié)果表明重組 PknA 對(duì)底物 ATP 的米氏常數(shù) Km 值為 0.174（圖 5），最大反應(yīng)速率 Vmax值為 20.70（Δm340/t）（圖 6）。

反應(yīng)速率（ΔmOD340/t）Reaction rate (ΔmOD340/t)60 50 40 30 20 10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 酶濃度（μg/100 μl）Enzyme concenration (μg/100 μl)

Figure 4 Correlation of reaction rate with the concentration of PknA

反應(yīng)速率（ΔmOD340/t）Reaction rate (ΔmOD340/t)30 25 20 15 10 5 0 2 4 6 8 10 12 底物 ATP 的濃度（mmol/L）Substrate concenration (mmol/L)

Figure 5 Correlation of reaction rate with the substrate concentration

–6 –4 –2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1/[S]

Figure 6 The curve of Michaelis-Menten equation

2.2.4 溫度對(duì)重組 PknA 酶活性的影響 本研究測(cè)定了不同溫度對(duì) PknA 酶活性的影響。結(jié)果表明：在 28 ~ 45 ℃范圍內(nèi)，反應(yīng)速率在 37 ℃時(shí)達(dá)到最大，因此選擇 37 ℃為最佳反應(yīng)溫度（圖 7）。

2.2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光值的影響 本研究測(cè)定了不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系的影響。結(jié)果表明在一定的時(shí)間范圍內(nèi)，反應(yīng)體系的Δm340值與反應(yīng)時(shí)間具有良好線性關(guān)系（圖 8）。反應(yīng)時(shí)間超過 50 min后，反應(yīng)基本結(jié)束，吸光度不再隨反應(yīng)時(shí)間降低。因此反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制在 50 min 之內(nèi)較好。

反應(yīng)速率（ΔmOD340/t）Reaction rate (ΔmOD340/t)35302520151050 28 33 37 39 42 45 反應(yīng)溫度（℃）Temperature (℃)

Figure 7 Effect of the temperature on absorption

圖 8 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光值的影響

Figure 8 Effect of reaction time on absorption

綜上所述，經(jīng)優(yōu)化后的酶反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度 37 ℃；反應(yīng)時(shí)間 50 min；酶濃度 9.5 μg/100 μl；底物 ATP 終濃度為 2 mmol/L。在此條件下，酶催化活性得到充分發(fā)揮，但又不致反應(yīng)速率過快，反應(yīng)速率處于良好的線性范圍內(nèi)。

2.3 藥物篩選模型的評(píng)價(jià)

2.3.1 DMSO 濃度對(duì)酶活性的影響 反應(yīng)體系中分別加入 0% ~ 7% 的 DMSO，觀察不同濃度的DMSO對(duì)反應(yīng)體系中酶活性的影響。結(jié)果表明，DMSO 濃度高于 2% 時(shí)340讀數(shù)明顯下降（圖 9）。因此確定體系中最高 DMSO 濃度不超過 2% 為宜。

2.3.2 反應(yīng)體系中各成分的影響 本研究對(duì)反應(yīng)體系中各成分：ATP、酶、Nus 蛋白、DMSO、A1 培養(yǎng)基抽提物、A2 培養(yǎng)基抽提物等在 340 nm 處吸收值的影響進(jìn)行了考察，計(jì)算該模型的信噪比 = 29.11/5.17 = 5.63，符合篩選模型信噪比大于 3 的要求（圖 10）。

反應(yīng)速率（ΔmOD340/t）Reaction rate (ΔmOD340/t)35302520151050 0 1 2 3 4 5 6 7 DMSO 濃度（%）DMSO concentration (%)

Figure 9 Effect of the DMSO concentration on enzyme activity

反應(yīng)速率（ΔmOD340/t）Reaction rate (ΔmOD340/t)302520151050 1 2 3 4 5 6 7 8 反應(yīng)體系中各成分Components

Figure 10 Effect of single component on the assay

2.3.3 孔板均一性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 本研究根據(jù)酶反應(yīng)體系中陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組的數(shù)據(jù)來計(jì)算變異系數(shù)（CV）以及Z'因子對(duì)模型進(jìn)行可行性分析，經(jīng)優(yōu)化的體系在 96 孔板中反應(yīng)，分別設(shè)陰性對(duì)照板（正常酶反應(yīng)體系）和陽(yáng)性對(duì)照板，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，每次反應(yīng)所需的試劑都需重新配制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所測(cè)得數(shù)據(jù)不存在明顯趨勢(shì)，無明顯邊緣效應(yīng)。CV陰性對(duì)照= 6.54% < 20%；CV陽(yáng)性對(duì)照= 3.56% < 20%；Z' = 0.77 > 0.4。各項(xiàng)指標(biāo)均符合模型篩選的要求。

表 1 陽(yáng)性樣品的抑酶活性及抗菌活性

2.4 微生物發(fā)酵液樣品的篩選結(jié)果

本研究一共篩選來自微生物發(fā)酵液庫(kù)樣品 4000 個(gè)。酶活抑制率大于 30% 的樣品認(rèn)定為陽(yáng)性，經(jīng)過 3 次生物學(xué)重復(fù)和假陽(yáng)性結(jié)果的排除，最終獲得 21 個(gè)具有抑制 PknA 活性的發(fā)酵液陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為 0.53%。由于恥垢分枝桿菌和海分枝桿菌 PknA 與結(jié)核分枝桿菌 PknA 在基因序列上有較高的相似性（經(jīng) NCBI 的 BLAST 序列比對(duì)，分別為 83% 和 87%），且我們前期實(shí)驗(yàn)表明，抗恥垢和海分枝桿菌活性與抗結(jié)核分枝桿菌活性具有一定的一致性。本研究采用平板法以這兩種分枝桿菌測(cè)定發(fā)酵液陽(yáng)性樣品的抗菌活性，結(jié)果表明 9 個(gè)發(fā)酵液陽(yáng)性樣品在酶水平和細(xì)胞水平均具有較好的生物學(xué)活性，結(jié)果見表 1。

2.5 微生物發(fā)酵液樣品的細(xì)胞存活率結(jié)果

本研究采用 MTT 試驗(yàn)，檢測(cè)了上述發(fā)酵液陽(yáng)性樣品對(duì)人單核-巨噬細(xì)胞 THP-1 和鼠單核-巨噬細(xì)胞 Raw264.7 的細(xì)胞存活率影響。9 個(gè)發(fā)酵液陽(yáng)性樣品中，僅有 1 個(gè)樣品 I09AA-02703 的細(xì)胞毒性較大，其余樣品細(xì)胞毒性較小，結(jié)果見表2。

表 2 陽(yáng)性樣品的細(xì)胞存活率（%）

2.6 微生物發(fā)酵液樣品的酶活特異性結(jié)果

本研究利用結(jié)核分枝桿菌PknB、PknG、PDF、PheRS 和人的 AKT1 酶活測(cè)定方法，初步考察了發(fā)酵液陽(yáng)性樣品的酶活抑制特異性，結(jié)果表明I10AA-02916、I09AA-02717、I09AB-02729、I08AB-00801 這4 個(gè)發(fā)酵液陽(yáng)性樣品對(duì) PknA 酶活抑制的特異性較好，并且對(duì)人蛋白激酶 AKT1 幾乎無抑制作用，靶向選擇性較好（表 3），值得進(jìn)一步深入研究。

表 3 陽(yáng)性樣品的酶活特異性（%）

3 討論

STPKs 已被研究證實(shí)是病原微生物重要的毒力因子。STPKs 在蛋白質(zhì)可逆磷酸化調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，例如應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞周期的調(diào)控以及生長(zhǎng)存活等。這種調(diào)控形式在所有生命進(jìn)化的過程中都是保守的。PknA 是結(jié)核分枝桿菌 STPKs 中最重要的分子之一，是結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)分裂和細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，在蛋白磷酸化的信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[21]。其作為潛在藥物靶點(diǎn)的地位已被廣泛認(rèn)同。本研究對(duì)結(jié)核分枝桿菌 PknA 進(jìn)行了克隆表達(dá)。由于其為跨膜蛋白，可溶性較差，表達(dá)時(shí)容易聚合成三種形式[22]。我們采用含有 Nus（約60 kD）標(biāo)簽的pET43.1a 構(gòu)建重組質(zhì)粒，相比使用pET28a 等表達(dá)質(zhì)粒，所得的目的蛋白可溶性有很大提高，并且獲得了純度較高的 Nus-PknA 融合蛋白，100 ml 培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體純化可得到 4.46 mg 目的蛋白，可以滿足大量篩選的要求。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Nus 蛋白并不影響酶活體系的測(cè)定與評(píng)價(jià)，保證了模型的可靠性。利用該模型篩選了庫(kù)存發(fā)酵液樣品 4000 個(gè)，對(duì)初篩陽(yáng)性菌株進(jìn)行重復(fù)發(fā)酵和篩選，選取對(duì) PknA 酶和mc2155、ATCC 927 均有活性的菌株作為復(fù)篩陽(yáng)性菌株。隨后對(duì)陽(yáng)性樣品的真核細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，最終得到了8 個(gè)發(fā)酵液陽(yáng)性樣品在酶水平和抗分枝桿菌方面均具有良好的活性且毒性較低。

目前研究已證明 PknA、PknB 和 PknG 是結(jié)核分枝桿菌 STPKs 中最重要的 3 個(gè)蛋白激酶。本研究選擇結(jié)核分枝桿菌另外兩個(gè) STPKs：PknB、PknG 和非 STPKs 的 PDF、PheRS，以及人蛋白激酶 AKT1 對(duì)陽(yáng)性樣品酶活特異性進(jìn)行了初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn) 9 個(gè)陽(yáng)性樣品對(duì)PDF、PheRS 和 AKT1 抑酶活性均較弱。部分陽(yáng)性樣品對(duì)結(jié)核分枝桿菌同一家族的PknB 和 PknG 也具有抑酶活性，但對(duì) PknB 的抑制活性具有一定的優(yōu)勢(shì)。推測(cè)原因可能為：①在結(jié)核分枝桿菌中，和基因序列相似性只有 14.0%，但它們的催化活性區(qū)域 PknA（residues 1-338）和 PknB（residues1-331）蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似性達(dá) 36.8%，激酶活化域中的兩個(gè)蘇氨酸殘基催化位點(diǎn)（Thr-172 和 Thr-174）位點(diǎn)相同，活性中心金屬離子均為 Mn2+[23]；②盡管 PknA 和 PknB 磷酸化的底物不同，如 PknA 能磷酸化細(xì)胞分裂蛋白 FtsZ 及GlmU、KasA、Wag31 等底物[24-25]，而 PknB 作用于 GarA、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、叉頭結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白 Rv0019c、PapA5 等，但 PknA 和 PknB 位于同一操縱子下，均為跨膜蛋白，具有相似生物生理作用，且都能被跨膜的 Mstp 蛋白去磷酸化[22]；③PknG 是可溶性蛋白，對(duì)于結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)以“持留”狀態(tài)長(zhǎng)期存活有著重要作用。PknA 和 PknG 在N 端激酶活化域也存在保守的氨基酸殘基，可能與個(gè)別陽(yáng)性樣品對(duì)其產(chǎn)生抑制作用相關(guān)。近來研究發(fā)現(xiàn)，PknB 通過N 端激酶活化域即能夠發(fā)揮磷酸化作用，但PknA 必須通過激酶活化域和近膜結(jié)構(gòu)域兩部分協(xié)同才能產(chǎn)生磷酸化作用[23]。金屬離子 Zn2+等對(duì)于它們的磷酸化速率也有不同程度的影響。PknA 和 PknB 兩個(gè)靶點(diǎn)的這些異同對(duì)我們的后續(xù)研究有著重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，抗恥垢分枝桿菌、海分枝桿菌的活性與抗結(jié)核分枝桿菌活性有著較好的一致性，但為了防止漏篩的發(fā)生，在后續(xù)的研究中，除評(píng)價(jià)上述 9 個(gè)陽(yáng)性樣品抗結(jié)核分枝桿菌活性外，也進(jìn)一步評(píng)價(jià)了其他酶水平陽(yáng)性樣品的抗結(jié)核分枝桿菌活性。對(duì)于具有較好抗結(jié)核分枝桿菌活性的樣品，因微生物發(fā)酵液成分復(fù)雜，即使是出現(xiàn)粗提品酶活抑制特異性不強(qiáng)或細(xì)胞毒性較大的情況，我們都將通過初步的分離純化工作，進(jìn)一步考察活性成分和毒性成分是否可以分開，以及會(huì)不會(huì)是不同的組分造成的酶活抑制選擇性不強(qiáng)等問題。后期將針對(duì)具有抗結(jié)核分枝桿菌活性的陽(yáng)性樣品進(jìn)行活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定工作，為發(fā)現(xiàn)新型微生物來源的抗耐藥結(jié)核分枝桿菌先導(dǎo)化合物打下基礎(chǔ)。

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Establishment and application of a high throughput screening assay for inhibitors ofPknA

LUO Rui, XU Jian, WEI Yu-zhen, LI Hai-long, LIU Hong-yu, SU Jing, ZHAO Li-li, ZHANG Yu-qin, YU Li-yan

To establish and validate a high throughput assay for screening the inhibitors ofPknA.

Agene from the genome DNA ofH37Rv was amplified and recombinant plasmid pET43.1a-was constructed to express the PknA protein in. Using purified PknA, a high throughput screening model was established and optimized to screen for PknA inhibitors. The microbial fermentation extracts were screened using the screening assay, and the anti-bacterial activity, cytotoxicity and specific inhibitory effect of positive samples were further assessed.

21 out of 4000 microbial fermentation extracts were identified with inhibitory effect on activity of PknA, among which 4 samples showed antibacterial activity, lower cytotoxicity and better specificity of inhibitory effect.

The establishment of high throughput screening method and these 8 positive microbial fermentation extracts will facilitate the development of novel antitubercular agents.

Cyclic AMP-dependent protein kinases; Drug evaluation, preclinical; Antitubercular agents; High throuphput screening

YU Li-yan, Email: yly@cpcc.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.002

國(guó)家自然科學(xué)基金（30970038、81373452）；國(guó)家微生物資源平臺(tái)（NIMR-2013-3）；國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2014ZX09201001-011）

余利巖，Email：yly@cpcc.ac.cn

2014-05-04

Author Affiliation: Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China