GSK3β抑制劑SB216763通過激活小鼠成纖維細胞自噬相關(guān)蛋白抑制TGF-β1誘導的I型膠原產(chǎn)生

劉虹，王佳平，辛冰牧，邵榮光

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GSK3β抑制劑SB216763通過激活小鼠成纖維細胞自噬相關(guān)蛋白抑制TGF-β1誘導的I型膠原產(chǎn)生

劉虹，王佳平，辛冰牧，邵榮光

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所（劉虹、邵榮光）；100094 北京，中國航天員科研訓練中心（王佳平、辛冰牧）

探討 SB216763 對小鼠成纖維 3T3-NIH 細胞 I 型膠原表達和分泌的影響。

使用轉(zhuǎn)化生長因子 TGF-β1 誘導膠原的表達，使用天狼猩紅染色試劑盒及 Western blot 檢測 I 型膠原和自噬相關(guān)蛋白的表達。

給予 TGF-β1 后，細胞培養(yǎng)上清中膠原含量從（11.85 ± 0.90）mg/ml 上升至（16.70 ± 0.67）mg/ml（< 0.001），說明TGF-β1 可以劑量依賴地促進成纖維細胞中膠原的表達與分泌；同時，TGF-β1 還可以抑制自噬相關(guān)蛋白 Vsp34、Beclin-1 的表達，促進 p62 的堆積；給予 SB216763 后，細胞培養(yǎng)上清中膠原的含量從（16.83 ± 0.47）mg/ml 下降為（13.16 ± 0.45）mg/ml（< 0.05），說明 SB216763 可以降低 TGF-β1 誘導 I 型膠原的表達；此外，SB216763 還可以恢復成纖維細胞中自噬相關(guān)蛋白 Vsp34、Beclin-1 的表達，降低 p62 的表達。

小分子抑制劑 SB216763 通過激活自噬活性抑制 TGF-β1 誘導的 I 型膠原表達。

自噬； 膠原 I 型； 轉(zhuǎn)化生長因子 β1； SB216763

肺纖維化是各種內(nèi)、外致病原引起慢性肺疾病的共同后果，以肺組織炎癥和纖維化為共同病理特征，嚴重威脅人類健康和生命[1]。肺纖維化可引起肺泡持續(xù)性損傷、細胞外基質(zhì)反復破壞、修復、重建并過度沉積，導致正常肺組織結(jié)構(gòu)改變、功能喪失[2]。此外，多種慢性肺疾病，包括哮喘、慢性支氣管炎、支氣管擴張、慢性阻塞性肺病、肺結(jié)核、肺癌、間質(zhì)性肺病等，均伴有纖維化病理改變[3]。細胞外基質(zhì)的過度沉積是肺纖維化疾病的主要病理改變，其主要來源是成纖維細胞，主要成分是不可溶性纖維蛋白膠原[4]。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）通過促進膠原的轉(zhuǎn)錄繼而導致膠原表達增加[5]；同時，在肺纖維化的肺組織中，膠原的降解能力也是被顯著抑制的[3, 6]。因此，恢復肺組織中膠原的降解能力，有可能成為治療肺纖維化疾病的新思路。

自噬是細胞的一種自我代謝過程，有利于細胞在外界刺激下維持自身穩(wěn)態(tài)平衡。近來有報道指出，在肺纖維化疾病中，自噬是降解膠原的主要方式[3, 6]。Fernandez 和Eickelberg[7]直接指出，在多種肺部疾病中，自噬是組織細胞維持代謝平衡、促進細胞生存的主要機制。上述研究報道均是在動物模型中探討自噬的活性與肺纖維化發(fā)生的關(guān)系，目前仍缺乏在細胞水平，尤其是在成纖維細胞中，自噬活化可以促進膠原降解的證據(jù)。

糖原合成激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，可以參與調(diào)控多種細胞活動，其中包括能量代謝、神經(jīng)細胞的形成及發(fā)育等。我們的前期工作表明，GSK3β 的小分子抑制劑SB216763 可以通過促進 Bcl-2 與 GSK3β 的結(jié)合，抑制 Bcl-2 與 Beclin-1 的結(jié)合，激活自噬核心復合物，從而上調(diào)自噬的活性[8]。然而，SB216763 能否通過活化自噬改善成纖維細胞中膠原的含量仍需要進一步證實。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 3T3-NIH 細胞購于中國醫(yī)學科學基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞培養(yǎng)中心，細胞使用DMEM培養(yǎng)基，10% FBS 培養(yǎng)，每隔 2 天傳代一次，細胞培養(yǎng)條件為 37 ℃、5% CO2。

1.1.2 主要試劑 DMEM 細胞培養(yǎng)基、進口血清FBS 和胰酶購于美國 Gibco 公司；天狼猩紅染色試劑盒購于英國 Biocolor 公司；SB216763、雷帕霉素及抗小鼠 p62 購于美國 Sigma-Aldrich 公司；抗小鼠 β-actin、Beclin-1、Vps34 抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司；I 型膠原抗體購于英國 Abcam 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度定量試劑盒購于碧云天生物科技研究所。

1.2 方法

1.2.1 天狼猩紅染色檢測 I 型膠原 根據(jù)文獻[6]的方法，使用轉(zhuǎn)化生長因子 TGF-β1 以不同的劑量（0、5 和 10 ng/ml）作用于小鼠成纖維細胞 48 h 后，收集細胞，4 ℃、600 ×離心 20 min 后取上清，按照膠原檢測試劑盒說明書檢測膠原含量。

1.2.2 Western blot 取適量培養(yǎng)細胞，加入 RIPA 裂解液后振蕩混勻，冰上放置 30 min，間或振蕩；4 ℃、4560 ×條件下離心 15 min。取上清，使用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，其具體步驟參照說明書進行。調(diào)節(jié)蛋白至相同濃度，分裝，加入 5 倍上樣緩沖液，96 ℃變性 10 min，一部分用于 SDS 電泳，一部分–80 ℃保存[3]；使用 Amersham 顯色系統(tǒng)顯色，經(jīng) Western blot 印跡分析軟件測出各條帶的光密度值并進行分析[6]。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1 促進小鼠成纖維細胞中膠原的產(chǎn)生

實驗結(jié)果顯示，給予TGF-β1 后，細胞培養(yǎng)上清中膠原含量從（11.85 ± 0.90）mg/ml 上升至（16.70 ± 0.67）mg/ml，說明 TGF-β1 可以劑量依賴地促進小鼠成纖維細胞分泌膠原（圖 1A）；同時，對成纖維細胞中膠原的表達量檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 可以劑量依賴地增加小鼠成纖維細胞胞內(nèi) I 型膠原以及 α-SMA 的表達（圖 1B）。以上結(jié)果說明，TGF-β1 可以促進成纖維細胞中膠原的產(chǎn)生。

2.2 TGF-β1 抑制小鼠成纖維細胞中自噬的活化

在單獨給予雷帕霉素（100 ng/ml）誘導自噬活化時，成纖維細胞中自噬活化蛋白 Vps34 以及Beclin-1 的表達增加，自噬活化蛋白 p62 表達有所降低，說明自噬被活化；而在給予 TGF-β1（5 ng/ml）后，Vps34 以及 Beclin-1 的表達水平有所降低，p62 表達升高，說明自噬的活性下降（圖 2）。以上的結(jié)果表明，TGF-β1 可以抑制雷帕霉素誘導的自噬活化。

圖 1 TGF-β1 誘導小鼠成纖維細胞中膠原的產(chǎn)生（A：天狼猩紅染色；B：Western blot）

Figure 1 Type I collagen was induced by TGF-β1 (A: Sirius red staining; B: Western blot)

圖 2 TGF-β1 抑制小鼠成纖維細胞中自噬的活化

Figure 2 Autophagy-related proteins were regulated by TGF-β1 in mouse fibroblast cells

圖 3 SB216763 抑制 TGF-β1 誘導的膠原產(chǎn)生（A：天狼猩紅染色；B：Western blot）

Figure 3 Increased type I collagen by TGF-β1 was reduced by SB216763 (A: Sirius red staining; B: Western blot)

2.3 小分子抑制劑 SB216763 抑制 TGF-β1 誘導的膠原產(chǎn)生

給予 TGF-β1（5 ng/ml）以及 SB216763（10 μmol/L）共同作用 48 h 后，我們發(fā)現(xiàn)細胞培養(yǎng)上清中膠原的含量從（16.83 ± 0.47）mg/ml 下降為（13.16 ± 0.45）mg/ml，說明 SB216763 可以降低 TGF-β1 誘導的膠原分泌（圖 3A）；此外，我們對小鼠成纖維細胞胞內(nèi) I 型膠原進行檢測，結(jié)果顯示，SB216763 可以降低小鼠成纖維細胞胞內(nèi) I 型膠原的含量（圖 3B）。以上的結(jié)果說明，在小鼠成纖維細胞中，SB216763 可以抑制 TGF-β1 誘導的膠原產(chǎn)生。

2.4 小分子抑制劑 SB216763 恢復成纖維細胞中自噬的活性

在 TGF-β1 誘導膠原表達的同時給予SB216763 刺激后，檢測自噬相關(guān)蛋白的表達。我們發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白 Vps34 及 Beclin-1 的表達水平有所降低，p62 表達升高，說明自噬的活性下降；而在給予 SB216763 刺激時，成纖維細胞中 Vps34 及 Beclin-1 的表達增加，p62 的表達有所降低，說明自噬被活化（圖 4）。以上的結(jié)果表明，SB216763 可以恢復自噬活性。

圖 4 SB216763 恢復小鼠成纖維細胞中自噬的活化

Figure 4 Autophagy-related proteins were regulated by SB216763 in mouse fibroblast cells

3 討論

組織纖維化是許多慢性疾病致殘和致死的主要原因，組織損傷是纖維化的始動環(huán)節(jié)。當疾病的病程較短、組織受損傷較小時，受損組織周邊的正常實質(zhì)細胞或少量的間質(zhì)細胞發(fā)生反應(yīng)性增生，促進損傷被修復，恢復正常組織結(jié)構(gòu)和功能，不會導致纖維化病理過程；如果組織受損傷嚴重，大量組織細胞壞死，會導致器官功能的衰竭，引起壞死后硬化或機體死亡；如果損傷長時間不愈合，反復出現(xiàn)細胞損傷壞死，超出了周圍正常實質(zhì)/間質(zhì)細胞的修復能力，則會造成實質(zhì)/間質(zhì)細胞不斷增生以修復受損的組織，即發(fā)生纖維化病理過程[9]。在上述過程中，受到損傷的組織（細胞）主要是指 3 種細胞，即成纖維細胞、上皮細胞和單核細胞[9]。其中，成纖維細胞是膠原沉積過程中膠原的主要來源[3]。因此，我們選擇了在成纖維細胞中觀察 SB216763 對膠原分泌的影響。

TGF-β1 在肺纖維化的過程中發(fā)揮了重要的作用。一方面，TGF-β1 可以活化核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)相關(guān)啟動子區(qū)組件，從而啟動膠原和纖連蛋白基因轉(zhuǎn)錄[10]，促進膠原的表達；另一方面，TGF-β1 還通過抑制膠原降解的過程，進一步加重膠原的沉積：增加自噬活性可以促進膠原的降解，從而改善組織中膠原的沉積[3, 6]；然而，在特發(fā)性肺纖維化患者的肺組織中，自噬活性是被顯著抑制的，TGF-β1 可以通過激活 mTORC1 抑制纖維母細胞中自噬的活性[11]。上述研究表明，TGF-β1 可以通過增加膠原轉(zhuǎn)錄及抑制膠原通過自噬途徑降解兩方面，共同促進膠原的沉積。

目前，已有證據(jù)表明 SB216763 可以調(diào)節(jié)纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究指出，SB216763 可以改善由博來霉素誘導的小鼠急性肺纖維化，同時降低炎性細胞因子[12]，但卻不能影響肺纖維化組織中膠原的轉(zhuǎn)錄水平[8]，說明SB216763 是有可能通過促進膠原降解降低膠原的表達。在體外培養(yǎng)的人肺成纖維細胞中，SB216763 可以抑制 TGF-β1 誘導的肌成纖維細胞標志物，抑制成纖維細胞的活化[13]。然而，也有報道指出，SB216763 可以通過激活 Wnt/β-caternin 信號通路加重皮膚纖維化[14]。以上的研究表明，SB216763 對纖維化疾病的調(diào)節(jié)作用可能存在組織差異性。

大量文獻表明，自噬活性與膠原的降解密切相關(guān)[3, 6]。Kim 等[15]也指出在腎纖維化中，TGF-β1 可以誘導膠原的產(chǎn)生，而活化自噬可以促進胞外膠原的降解。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SB216763 可以通過誘導多種自噬相關(guān)蛋白的產(chǎn)生（例如Beclin-1、Vps34 以及 p62），從而激活自噬的活化。Zhou 等[16]發(fā)現(xiàn)在缺血損傷的大鼠腦組織中，SB216763 可以促進LC3-II 的表達，增加 LC3 點狀聚集，從而改善其腦損傷情況。然而，也有報道表明，在具有耐藥性的慢性骨髓性白血病細胞中，SB216763 可以通過增加 Atg5 以及 mTOR 的蛋白表達水平，從而降低自噬的活性[17]。以上研究表明，SB216763 在纖維化疾病以及腫瘤中對自噬的活性具有不同的調(diào)節(jié)作用，這可能是由于 SB216763 抑制GSK3β 的活性后，導致一種生長因子被剝奪的生理狀態(tài)，而這種狀態(tài)在纖維化疾病以及腫瘤組織中會對自噬產(chǎn)生截然不同的影響。

自噬核心復合物在自噬的活化過程中發(fā)揮了重要的作用。在靜息狀態(tài)下，Bcl-2 通過BH3 結(jié)構(gòu)域與 Beclin-1 結(jié)合，抑制自噬的活化[18]。盡管 SB216763 可以抑制 Bcl-2 的降解[19]，但是，SB216763 可以通過促進 Bcl-2 與 GSK3β 的結(jié)合，抑制 Bcl-2 與 Beclin-1 的結(jié)合，激活自噬核心復合物，從而活化自噬的發(fā)生[8]。我們的結(jié)果顯示，SB216763 還可以通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白 Vps34、Beclin-1 以及 p62 的表達影響自噬的活化，上述研究補充了 SB216763 調(diào)控自噬活化的分子機制。

在本文中，我們發(fā)現(xiàn)在小鼠成纖維細胞中，GSK3β 抑制劑 SB216763 可以通過增加自噬相關(guān)蛋白的表達，激活自噬的發(fā)生，促進膠原的降解，最終改善由 TGF-β1 誘導的膠原分泌。本研究表明，使用小分子化合物 SB216763 適度激活自噬的活性，可以為改善肺纖維化提供新的治療思路與方案。

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GSK3β inhibitor SB216763 suppresses the expression and secretion of TGF-β1-induced collagen I through stimulating autophagy-related proteins in mouse fibroblast cells

LIU Hong, WANG Jia-ping, XIN Bing-mu, SHAO Rong-guang

The aim of this study is toinvestigate the effects of SB216763 on the expression and secretion of type I collagen in mouse fibroblast 3T3-NIH cells.

Type I collagen was induced by treatment with TGF-β1, and the expression of type I collagen was detected by Sirius red staining kit and Western blot. Autophagy related proteins were detected by Western blot.

TGF-β1 dose-dependently induced the expression and secretion of type I collagen from (11.85 ± 0.90)mg/ml to (16.70 ± 0.67)mg/ml (< 0.001) in 3T3-NIH cells. Meanwhile, TGF-β1 affected the expressions of autophagy-related proteins, as shown by the decrease of Vsp34 and Beclin-1, and the increase of p62. In contrast, SB216763 markedly reduced the expression and secretion of type I collagen from (16.83 ± 0.47)mg/ml to (13.16 ± 0.45)mg/ml (< 0.05). Moreover, SB216763 restored the levels of Vsp34 and Beclin-1, and down-regulated the expression of p62 in TGF-β1-treated cells.

SB216763 suppresses the expression and secretion of thetype I collagen induced by TGF-β1 through stimulating autophagy-related proteins in mouse fibroblast cells.

Autophagy; Collagen type I; Transforming growth factor beta 1; SB216763

SHAO Rong-guang, Email: shaor@imb.pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.001

國家自然科學基金（31401186）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX09301002-001- 015）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項（IMBF201407）

邵榮光，Email：shaor@imb.pumc.edu.cn

2014-04-22

Author Affiliations: Department of Oncology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (LIU Hong, SHAO Rong-guang); State Key Laboratory of Space Medicine Fundamentals and Application, China Astronaut Research and Training Centre, Beijing 100094, China (WANG Jia-ping, XIN Bing-mu)