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    天然海水高鹽條件對(duì)海綿相關(guān)細(xì)菌抗菌活性及次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響

    2014-11-01 07:05:46甄心鞏婷崔美子王瑞杉朱平
    中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2014年6期
    關(guān)鍵詞:淡水海綿海水

    甄心,鞏婷,崔美子,王瑞杉,朱平

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    天然海水高鹽條件對(duì)海綿相關(guān)細(xì)菌抗菌活性及次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響

    甄心,鞏婷,崔美子,王瑞杉,朱平

    100050 北京,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)天然藥物生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

    海洋微生物生活在高鹽、高壓、低溫、低光照、寡營養(yǎng)、弱堿性的海洋環(huán)境中,因而形成了獨(dú)特的生理特征和代謝機(jī)制,可產(chǎn)生與陸生微生物結(jié)構(gòu)與活性迥然不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物,如生物堿、萜類、環(huán)肽類和聚酮類等[1-2],成為海洋藥物的重要來源之一。從海洋放線菌中分離得到的 salinisporamide A 已經(jīng)完成了I期臨床研究,用于治療多發(fā)性骨髓瘤[3]。以從海洋真菌sp. CNC-139 中獲得的化合物為模板合成的 plinabulin(NPI-2358)已經(jīng)進(jìn)入II期臨床研究,用于治療非小細(xì)胞肺癌[4]。來自于卡納里水域深海沉積物中的鏈霉菌 NTK937 產(chǎn)生的 caboxamycin是一種新型的苯并噁唑抗生素,顯示出較強(qiáng)的抗菌活性,對(duì)革蘭陽性菌枯草芽孢桿菌()IC50僅為8 μmol/L[5]。海洋是一個(gè)特殊的生態(tài)系統(tǒng),據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,通過模擬海洋環(huán)境的擬生態(tài)培養(yǎng),可以誘導(dǎo)海洋真菌產(chǎn)生新的活性代謝產(chǎn)物[6-9]。同時(shí)有研究表明,高鹽條件造成的極端環(huán)境(如高滲透壓和營養(yǎng)剝奪等)可以激活生物體內(nèi)的沉默基因或次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶,進(jìn)而使海洋等來源的耐鹽真菌產(chǎn)生新的活性化合物[10-11]。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,培養(yǎng)基鹽度對(duì)海洋真菌的活性物質(zhì)具有顯著影響,其生物活性和活性物質(zhì)的種類和產(chǎn)量可能有較大的差別[12-13]。但是,應(yīng)用天然海水培養(yǎng)基探討海洋來源細(xì)菌的抗菌活性、次級(jí)代謝產(chǎn)物的 HPLC 化學(xué)指紋的報(bào)道較少,本實(shí)驗(yàn)室曾研究報(bào)道天然海水對(duì)海綿相關(guān)細(xì)菌的抗菌活性有影響[14]。另有文獻(xiàn)對(duì)細(xì)菌 HPLC 化學(xué)指紋研究進(jìn)行了報(bào)道[15-17],此外,有文獻(xiàn)報(bào)道天然海水可影響細(xì)菌的生長[18-19]。本文以海綿相關(guān)細(xì)菌為主要研究對(duì)象,初步開展了相關(guān)探索,以期獲得具有良好抗菌活性且次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富的菌株。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 供試菌株 本實(shí)驗(yàn)所涉及的海綿相關(guān)細(xì)菌分離自相似蜂海綿()或豐肉結(jié)海綿(),兩株海綿均采集自我國南海陵水縣新村港附近海域[14,20],均為本實(shí)驗(yàn)室保存。用于抗菌活性篩選的指示菌為枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501,購自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    ⑴LB 培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L,pH 7.0,固體培養(yǎng)基加入 1.5% 的瓊脂。121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

    ⑵生物檢定培養(yǎng)基:胰蛋白胨 5 g/L、牛肉膏 3 g/L、酵母提取物 1.5 g/L,pH 7.2 ~ 8.0,上層加入 0.8% 瓊脂,下層加 1.5% 瓊脂。121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

    1.1.3 儀器 Agilent 1200 分析型液相色譜儀、色譜柱 ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm × 150 mm,5 μm)均為美國 Agilent 公司產(chǎn)品;HZQ-Q 恒溫振蕩搖床由哈爾濱東聯(lián)科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

    1.1.4 試劑 乙酸乙酯購自北京化學(xué)試劑廠;色譜純甲醇購自北京宏達(dá)欣宇科技有限公司;酵母提取物和胰蛋白胨購自英國 Oxoid 公司;瓊脂購自北京拜爾迪生物科技有限公司;牛肉膏購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。天然海水于 2013 年 9 – 10 月取自河北省秦皇島市北戴河;淡水采用蒸餾水。

    1.2 方法

    1.2.1 天然海水的高鹽條件對(duì)海綿相關(guān)細(xì)菌抗菌活性的影響 將待測(cè)菌株以滅菌牙簽分別點(diǎn)種于天然海水和淡水(對(duì)照)LB 固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng) 24 ~ 36 h,長出菌落。將指示菌枯草芽孢桿菌 63501 菌懸液加入冷卻至 50 ℃的上層生物檢定培養(yǎng)基中(濃度為 3%),迅速搖勻,以滅菌移液管吸取適量添加到已經(jīng)接種的下層培養(yǎng)基平板上,使其均勻分布,37 ℃培養(yǎng)過夜,測(cè)量抑菌圈直徑,并觀察清晰程度以評(píng)價(jià)其抗菌活性[14,21-22]。

    1.2.2 天然海水的高鹽條件對(duì)海綿相關(guān)細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物 HPLC 指紋的影響 將活化好的菌株分別接種到天然海水和淡水(對(duì)照)LB 液體培養(yǎng)基中,于 37 ℃,200 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng) 2 d,采用 3 倍乙酸乙酯對(duì)不同的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行提取,粗提物用甲醇充分溶解至 10 mg/ml,進(jìn)行 HPLC 檢測(cè),流速:1 ml/min;檢測(cè)波長:200 ~ 400 nm 全波長掃描;梯度洗脫條件:0 → 50 min 從 10% 甲醇水溶液線性提高到 100% 甲醇。通過液相色譜圖上色譜峰的數(shù)量及峰面積對(duì)比次級(jí)代謝產(chǎn)物成分及含量。

    2 結(jié)果

    2.1 天然海水的高鹽條件對(duì)海綿相關(guān)細(xì)菌抗菌活性的影響

    在 120 株海綿相關(guān)細(xì)菌中,共有 46 株(38.3%)細(xì)菌在天然海水和(或)淡水 LB 固體培養(yǎng)基上顯示出了抗菌活性,我們將這 46 株細(xì)菌在兩種培養(yǎng)基上的抗菌活性進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果總結(jié)歸納為表 1。46 株活性菌株可分為 4 組:第I組的 11 株菌株在天然海水培養(yǎng)基上表現(xiàn)出了抗菌活性,而在淡水培養(yǎng)基上無抗菌活性,其中有 3 株菌株(HLSB303、HLSB3、HLSB228)在天然海水培養(yǎng)基上抑菌圈直徑較大且清晰,顯示出了較強(qiáng)的抗菌活性。第II組共有 25 株細(xì)菌,占活性菌株的半數(shù)以上,其在天然海水培養(yǎng)基上的抗菌活性均大于各自在淡水培養(yǎng)基上的活性,其中除了 HLSB264、HLSB25 和 LS56 的活性相對(duì)較弱,其余 22 株細(xì)菌在海水培養(yǎng)基上的活性較為明顯,抑菌圈大且清晰;有些菌落直徑雖小于其在淡水培養(yǎng)基上的菌落直徑,但其抑菌圈卻明顯大于其在淡水培養(yǎng)基上的抑菌圈。第III組的 7 株細(xì)菌在兩種培養(yǎng)基上的抗菌活性相似,但除了 LS52 以外,其余菌株的抗菌活性均不夠強(qiáng)。第IV組的3 株細(xì)菌中,LS26 和 LS7 在淡水培養(yǎng)基上表現(xiàn)出微弱抗菌活性而在海水培養(yǎng)基上無活性;LS165 在淡水培養(yǎng)基上具有一定抗菌活性而在海水培養(yǎng)基上表現(xiàn)出微弱的抗菌活性,總的說來該組的抗菌活性均不夠強(qiáng)。另外,由于菌落大小有差異,菌株之間在相同培養(yǎng)基上的抑菌圈大小不具有可比性,但同一菌株在兩種培養(yǎng)基上的抑菌圈大小則可進(jìn)行比較;有些菌株在海水培養(yǎng)基上的菌落甚至小于其在淡水培養(yǎng)基上的菌落,但在海水培養(yǎng)基上的抑菌圈直徑卻大于其在淡水培養(yǎng)基上的抑菌圈直徑。

    2.2 天然海水的高鹽條件對(duì)海綿相關(guān)細(xì)菌中小極性次級(jí)代謝產(chǎn)物 HPLC 指紋的影響

    從上述 46 株細(xì)菌中選取了 16 株具有一定代表性的菌株,對(duì)其在天然海水和淡水 LB 液體培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的中小極性次級(jí)代謝產(chǎn)物的 HPLC 指紋圖譜進(jìn)行了對(duì)比,觀察兩種培養(yǎng)基上的代謝產(chǎn)物是否存在差異,部分結(jié)果見圖 1(以波長 254 nm 處為例)。

    首先,僅在天然海水固體培養(yǎng)基上才表現(xiàn)出抗菌活性的細(xì)菌在天然海水液體培養(yǎng)基中的次級(jí)代謝產(chǎn)物也更為豐富,如第I組的菌株 HLSB3(FJ999554)。說明在天然海水高鹽條件的刺激下,這些細(xì)菌的某些合成代謝途徑被激活,產(chǎn)生了不同于淡水培養(yǎng)基的次級(jí)代謝產(chǎn)物,包括抗菌活性物質(zhì)。

    其次,與淡水固體培養(yǎng)基相比較,在天然海水固體培養(yǎng)基上的抗菌活性更高的細(xì)菌在次級(jí)代謝產(chǎn)物的 HPLC 指紋圖譜對(duì)比上表現(xiàn)出兩種結(jié)果:一種結(jié)果是,在兩種液體培養(yǎng)基中的次級(jí)代謝產(chǎn)物的種類大體相似,但含量有所不同,提示我們含量有所增加的成分極有可能是主要的抗菌活性成分,有必要進(jìn)行進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證,此類菌株如圖 1B。另一種是與淡水(對(duì)照)液體培養(yǎng)基相比,其在天然海水液體培養(yǎng)基中的次級(jí)代謝產(chǎn)物種類更為豐富,含量也高,如菌株 HLSB4,這些只在天然海水培養(yǎng)基中出現(xiàn)和(或)含量增加的成分極有可能包含著抗菌活性物質(zhì)。

    表 1 天然海水高鹽條件對(duì)海綿相關(guān)細(xì)菌抗菌活性影響

    注:+ 表示有一定的抗菌活性;± 表示有微弱抗菌活性;–表示無抗菌活性。

    保留時(shí)間(min)A保留時(shí)間(min)B 保留時(shí)間(min)C保留時(shí)間(min)D

    最后,有些菌株如 HLSB154 雖然在天然海水培養(yǎng)基上的次級(jí)代謝產(chǎn)物更為豐富,抗菌活性卻沒有明顯提高,說明海水高鹽條件刺激了其他物質(zhì)的生成。

    3 討論

    海洋微生物由于受到海洋環(huán)境高鹽、寡營養(yǎng)等非生物因子的脅迫,產(chǎn)生獨(dú)特的代謝機(jī)制,因而代謝類型比較復(fù)雜,表現(xiàn)在次級(jí)代謝產(chǎn)物方面,可能刺激某些次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,也有可能會(huì)抑制另一些次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成[23-24],使它們?cè)诓煌纳L條件下分泌不同類型的化合物[25-26],表現(xiàn)出不同的藥理活性。本文研究了天然海水的高鹽條件對(duì)相似蜂海綿和豐肉結(jié)海綿相關(guān)細(xì)菌的抗菌活性、中小極性次級(jí)代謝產(chǎn)物 HPLC 指紋圖譜的影響,發(fā)現(xiàn)天然海水的高鹽條件可以誘導(dǎo)一些海洋來源的細(xì)菌產(chǎn)生抗菌活性、或明顯提高其抗菌活性,增加其次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性。與淡水相比較,在海水高鹽條件下存在差異的組分中有一些可能是關(guān)鍵的抗菌活性物質(zhì),在尋找新抗生素等生理活性物質(zhì)的過程中應(yīng)給予重點(diǎn)關(guān)注。我們推測(cè):在天然海水高鹽條件的刺激下,恢復(fù)了抗菌活性的菌株可能是由于其體內(nèi)參與抗生素生物合成的沉默基因被激活;而那些抗菌活性得到增強(qiáng)的菌株,可能是因?yàn)槠涑聊虮患せ疃a(chǎn)生了原先未曾產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì),亦有可能其活性產(chǎn)物譜未發(fā)生變化但相關(guān)酶表達(dá)水平的提高促進(jìn)了某些抗菌活性產(chǎn)物的合成。海水高鹽條件還有可能刺激其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成。當(dāng)然,海水高鹽條件也可能對(duì)另外一些抗菌活性物質(zhì)的合成酶系無作用,或者有抑制作用,表現(xiàn)為在兩種培養(yǎng)基上的活性相當(dāng)或在天然海水培養(yǎng)基上抗菌活性降低。本研究結(jié)果提示我們,海洋微生物存在著合成某些次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛能,如果設(shè)法讓這些潛能得以發(fā)揮,極有可能發(fā)現(xiàn)新的活性代謝產(chǎn)物。海洋微生物已成為創(chuàng)新藥物研究的重要源泉之一,具有廣闊的開發(fā)前景。

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    朱平,Email:zhuping@imm.ac.cn

    2014-03-17

    10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.013

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