不同品種葡萄干中有機(jī)酸的成分分析

徐秀娟，屈 展，何保江，楊偉平，陳芝飛，蘆昶彤，孫志濤，胡 軍，張文娟*

（1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院 煙草行業(yè)煙草香料基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001；2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450016）

0 前言

葡萄科葡萄屬植物葡萄的果實(shí)，又名草龍珠、蒲桃，在日光下曬干或在陰影下晾干成為葡萄干.其本質(zhì)是一個(gè)自然發(fā)酵過(guò)程，葡萄的質(zhì)量和體積都減小，其中可溶性固形物的含量達(dá)到了微生物難以生長(zhǎng)利用的程度[1]，水活度也逐漸下降，這將有利于葡萄干在存儲(chǔ)過(guò)程中保持穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)和感官品質(zhì)[2].

有機(jī)酸是葡萄及其制品的主要風(fēng)味物質(zhì)之一，其種類及含量與產(chǎn)品的穩(wěn)定性和品質(zhì)有較大關(guān)系[3].目前，對(duì)葡萄、葡萄皮及葡萄酒中有機(jī)酸的研究較多[4-11]，而對(duì)葡萄干的研究相對(duì)較少[12]，對(duì)不同品種葡萄干中有機(jī)酸的種類進(jìn)行定性分析，并對(duì)其中含量較多的有機(jī)酸進(jìn)行定量分析的研究還未見(jiàn)報(bào)道.葡萄干與葡萄不同，在晾曬過(guò)程中可能會(huì)由于微生物發(fā)酵產(chǎn)生新的有機(jī)酸，且不同品種的葡萄干，其原料及晾曬方式不同，所含有機(jī)酸的種類及含量也會(huì)有差異.因而，開(kāi)展葡萄干中有機(jī)酸的成分分析，有助于了解晾曬過(guò)程中發(fā)生的變化，為葡萄干的品質(zhì)控制以及天然植物的提取、應(yīng)用提供理論指導(dǎo).

目前，有機(jī)酸的分析檢測(cè)方法主要有：氣相色譜法[8，12]、高效液相色譜法[4，6，7，10]、離子色譜法[13]、薄層色譜法[14]、酸堿滴定法等.其中，酸堿滴定法主要是測(cè)定總酸含量；離子色譜法雖然靈敏度極高，但對(duì)樣品前處理要求高.GC-MS 和HPLC 是常用的分析方法，由于部分有機(jī)酸的揮發(fā)性較差，因此，在采用GC-MS 方法分析時(shí)，需對(duì)樣品進(jìn)行一定的衍生化處理；高效液相色譜法前處理簡(jiǎn)單，適合高沸點(diǎn)的非揮發(fā)性有機(jī)酸的測(cè)定，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高.綜上所述，作者以新疆的8 種葡萄干為研究對(duì)象，考察了不同提取方法對(duì)有機(jī)酸提取率的影響，采用甲酯化方法對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，通過(guò)GC-MS 對(duì)葡萄干中的有機(jī)酸進(jìn)行定性分析，并通過(guò)HPLC 對(duì)其中含量較高的有機(jī)酸進(jìn)行定量分析.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用原料為購(gòu)買于新疆的8 種葡萄干，且經(jīng)過(guò)新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所張付春老師的鑒定.8 種葡萄干品種分別是：和田紅（hotan red）、索索（black corinth）、馬奶子（manaizi）、木納格（munake）、巨峰（kyoho）、無(wú)核白雞心（centennial seedless）、無(wú) 核 白（thomposn seedless）、無(wú) 核 紫（monukka）.

DL-酒石酸：純度99.5%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；蘋果酸：純度99.5%，Sigma Aldrich 公司；檸檬酸：純度99.5%，美國(guó)New Jersey 公司；屈臣氏蒸餾水；二氯甲烷、硫酸：AR，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲醇、磷酸：HPLC，德國(guó)Merck 公司；磷酸氫二銨：AR，上海國(guó)藥.

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent Technologies 7890A-5975C GC-MS 分析儀器、Agilent Technologies-1290-Infinity 高效液相色譜儀-DAD 檢測(cè)器：Agilent；JHBE-50 閃式提取器、SC-2544 離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；KH-700DE 超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3C 型pH 計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 葡萄干提取物的制備

水提：取和田紅葡萄干50.00 g 剪碎，用150 mL 蒸餾水浸泡1 h，待葡萄干充分吸水膨脹后利用閃式提取器處理1 min，放入超聲儀中超聲提取0.5 h，再經(jīng)50 ℃水浴提取0.5 h，過(guò)濾后離心分離上清液（4 000 r/min，20 min），上清液減壓濃縮至干，得到和田紅葡萄干浸膏28.92 g，產(chǎn)率57.84%.

80%醇提：取和田紅葡萄干50.00 g 剪碎，用150 mL 80%乙醇浸泡1 h，待葡萄干充分膨脹后用閃式提取器處理1 min，放入超聲儀中超聲提取0.5 h，再經(jīng)50 ℃水浴提取0.5 h，過(guò)濾后離心分離上清液（4 000 r/min，20 min），上清液減壓濃縮至干，得到和田紅葡萄干浸膏27.01 g，產(chǎn)率為54.02%.

酸提[10，15]：取和田紅葡萄干50.00 g 剪碎，用150 mL 含1%（體積比）1 mol/L 的H3PO4的水溶液浸泡1 h，待葡萄干充分膨脹后用閃式提取器提取，放入超聲儀中超聲提取0.5 h，再經(jīng)50 ℃水浴提取0.5 h，過(guò)濾后離心分離上清液（4 000 r/min，20 min），上清液減壓濃縮至干，得到和田紅葡萄干浸膏24.37 g，產(chǎn)率為48.74%.

1.3.2 試劑的配制

12.5 %的硫酸-甲醇（V/V）溶液的配制：用量筒量取350 mL 甲醇溶液，倒入1 000 mL 燒杯中，用量筒取50 mL 濃硫酸，在冰浴條件下緩慢將硫酸加入到甲醇中，在此過(guò)程中需不斷攪拌，以免硫酸放熱導(dǎo)致甲醇揮發(fā)而使甲酯化試劑失效.

0.01 mol/L 的磷酸氫二銨溶液：準(zhǔn)確稱取1.320 6 g（NH4）2HPO4試劑，用蒸餾水定容于1 L容量瓶中，使用時(shí)用1 mol/L H3PO4調(diào)節(jié)至所需的pH 值.

HPLC 用待測(cè)樣品的配制：準(zhǔn)確稱取葡萄干浸膏10.00 mg，溶解后定容于10 mL 容量瓶中，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?使用時(shí)，用移液管取適量溶液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移到2 mL 色譜瓶中待用.

HPLC 用混合標(biāo)樣的配制：準(zhǔn)確稱取酒石酸10.00 mg、蘋果酸1.00 mg、檸檬酸1.00 mg，用蒸餾水充分溶解，定容于50 mL 容量瓶中，作為有機(jī)酸的混合標(biāo)準(zhǔn)母液.然后依次從母液中移取4.0、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0.25 mL，分別定容于5 mL 容量瓶中.將不同濃度的混合有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)液，經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移到色譜瓶中備用.

1.3.3 有機(jī)酸的甲酯化

稱取0.5 g 和田紅葡萄干浸膏于圓底燒瓶中，加5 mL 蒸餾水溶解，然后加入12.5%的硫酸-甲醇甲酯化試劑5 mL，在70 ℃條件下水浴加熱30 min.冷卻后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入二氯甲烷萃取3 次（5 mL×3），合并有機(jī)相，加入3 g 無(wú)水硫酸鈉靜置干燥0.5 h.過(guò)濾后將濾液減壓濃縮至5 mL備用.

1.3.4 GC-MS 儀器條件

色譜條件：DB-5MS（60 m×250 μm，0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管色譜柱；程序升溫：初溫50 ℃，以3 ℃/min 升至280 ℃，保持5 min；載氣：氦氣；流速：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；進(jìn)樣方式：分流；分流比：5∶1.

質(zhì)譜條件：EI 源電子能量70 eV，電子倍增器電壓1 600 V；質(zhì)量掃描范圍：33～600 AMU；參數(shù)采集模式：全掃描；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；溶劑延遲：6 min.

數(shù)據(jù)分析：根據(jù)葡萄干浸膏衍生化產(chǎn)物的全掃描總離子流色譜圖，用NIST08.L 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行聯(lián)機(jī)檢索，定性分析所含有機(jī)酸成分.

1.3.5 HPLC 儀器條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.01 mol/L 磷酸氫二銨-磷酸緩沖鹽溶液（體積比為3∶97，pH 3.2）；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL.

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS 對(duì)葡萄干中有機(jī)酸的定性分析

對(duì)于葡萄干中有機(jī)酸的提取共采用3 種方法：水提、醇提和酸提.以和田紅為例，將3 種方法所得葡萄干浸膏，經(jīng)硫酸-甲醇甲酯化后進(jìn)樣分析，其中水提物的色譜圖如圖1 所示，經(jīng)譜庫(kù)檢索后共鑒定出8 種有機(jī)酸，其他兩種提取方法的分析結(jié)果見(jiàn)表1.酸提法測(cè)得的有機(jī)酸種類最少，醇提所得浸膏中有機(jī)酸的種類最多，3 種方法共檢測(cè)出10 種有機(jī)酸.3 種方法都可檢測(cè)出的酯化產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的有機(jī)酸有6 種，分別為乙酰丙酸、富馬酸、丁二酸、DL-蘋果酸、L-（+）-酒石酸和檸檬酸.同時(shí)，以葡萄干中3 種主要有機(jī)酸酒石酸、蘋果酸和檸檬酸的峰面積作為指標(biāo)，考察3 種方法對(duì)有機(jī)酸的提取效率.將3 種提取方法下主要有機(jī)酸及其對(duì)應(yīng)的峰面積進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2 所示.從圖2 可見(jiàn)，水提法對(duì)酒石酸的提取效率明顯高于另外兩種方法，水提法和醇提法對(duì)蘋果酸的提取效率相當(dāng)，酸提法對(duì)蘋果酸的提取效率最低.由于葡萄及葡萄制品中含量較高的有機(jī)酸是酒石酸、蘋果酸和檸檬酸，因而為保證3 種有機(jī)酸都有較高的提取效率，后續(xù)試驗(yàn)均采用水提法所得樣品進(jìn)行分析.和田紅的GC-MS 圖譜中鑒定出的8 種有機(jī)酸分別為乙酰丙酸、富馬酸、琥珀酸、DL-蘋果酸、L-（+）-酒石酸、檸檬酸、十六碳酸和十八碳酸，其中含量較高為蘋果酸和酒石酸.

圖1 和田紅甲酯化全掃描總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of esterified Hotan Red

表1 3 種提取方法的比較Table 1 The comparison of three different extraction methods

圖2 不同提取方法有機(jī)酸峰面積柱狀圖Fig.2 The histogram of peak area of organic acids extracted by different methods

將其他7 種葡萄干采用同樣的方法提取，甲酯化后進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)表2.8 種葡萄干中共鑒定出的有機(jī)酸種類多達(dá)17 種，品種不同，所含有機(jī)酸的種類差異較大.以上8 種葡萄干均含有的有機(jī)酸為乙酰丙酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸和十六碳酸.含有機(jī)酸種類最多的品種是索索，索索除含共有的有機(jī)酸外，還含有草酸、琥珀酸、戊二酸、2-甲氧基丁二酸、3-羥基-3-甲基-1，5-戊二酸、鄰苯二甲酸、反-9，12-十八碳二烯酸、7，10，13-十六碳三烯酸和十八碳酸.含有機(jī)酸種類最少的是和田紅和無(wú)核白，其中，無(wú)核白除含共有的有機(jī)酸外，還含有乳酸、鄰苯二甲酸和反-9，12-十八碳二烯酸.含量較少的戊二酸、2-甲氧基丁二酸、3-羥基-3-甲基-1，5-戊二酸和7，10，13-十六碳三烯酸只有某個(gè)品種的葡萄干才含有.在這些有機(jī)酸中，酒石酸、蘋果酸和檸檬酸是葡萄制品中最重要的有機(jī)酸，是通過(guò)葉片的光合作用產(chǎn)生的，隨著葡萄生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)，產(chǎn)生了其他的酸類物質(zhì).對(duì)于葡萄干而言，根據(jù)葡萄干品種及晾曬方式的不同，在發(fā)酵過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸.因而，葡萄干中有機(jī)酸成分的差異可能與所用葡萄品種有關(guān)，也可能與晾曬過(guò)程中自身的發(fā)酵有關(guān).

在定量分析上，GC-MS 存在一些缺陷，有機(jī)酸的揮發(fā)性較差，因而需要經(jīng)過(guò)衍生化后再分析，衍生化操作比較麻煩、費(fèi)時(shí)，而且可能存在衍生化不完全的問(wèn)題，因此本試驗(yàn)選擇高效液相色譜法對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行定量分析.

2.2 HPLC 對(duì)葡萄干的定量分析

2.2.1 色譜條件的選擇

本試驗(yàn)采用的是C18 反相鍵合色譜柱，檢測(cè)對(duì)象為葡萄干中含量較多的3 種酸，即酒石酸、蘋果酸和檸檬酸.由于3 種酸具有親水性，在C18 柱上的保留較弱，如果在配制溶液時(shí)混入有機(jī)溶劑，將會(huì)使有機(jī)酸在C18 柱上的保留更弱，縮短保留時(shí)間，容易出現(xiàn)色譜峰重疊的現(xiàn)象，所以直接使用蒸餾水做溶劑.

首先考察進(jìn)樣量的選擇，在相同條件下，將進(jìn)樣量依次設(shè)置為5、10、20 μL.結(jié)果顯示當(dāng)進(jìn)樣量為5 μL 時(shí)，峰形較??；當(dāng)進(jìn)樣量增大到20 μL 時(shí)，峰形過(guò)大；當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL 時(shí)，峰形適中，故選擇進(jìn)樣量為10 μL.

表2 8 種葡萄干中有機(jī)酸成分GC-MS 檢測(cè)結(jié)果Table 2 GC-MS results of organic acids composition in different raisins

在pH 為3.2、柱溫30 ℃、流速0.5 mL/min 的條件下，把甲醇-磷酸氫二銨緩沖鹽溶液的體積比依次調(diào)整為1∶99、2∶98、3∶97、5∶95、10∶90，將3 種有機(jī)酸混標(biāo)溶液依次在上述5 個(gè)洗脫條件下進(jìn)樣分析，得到混標(biāo)的分離色譜圖.隨著甲醇在流動(dòng)相中所占比例的增大，有機(jī)酸的洗脫速度加快，出峰時(shí)間提前，甲醇比例過(guò)大會(huì)導(dǎo)致混標(biāo)中3 種有機(jī)酸的色譜峰發(fā)生重疊，不能實(shí)現(xiàn)基線分離，而1∶99、2∶98 和3∶97 的分離效果較好，考慮到相同條件下，對(duì)色譜柱的保護(hù)，采用甲醇-緩沖鹽（V/V）為3∶97的流動(dòng)相對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行洗脫.

流速會(huì)影響有機(jī)酸的分離效果，因而考察了不同流速對(duì)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖的影響.在檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL，甲醇-磷酸氫二銨緩沖鹽（pH 3.2，體積比為3∶97），柱溫30 ℃條件下，分別以0.4、0.5、0.6、0.8 mL/min 的流速進(jìn)樣.結(jié)果表明，當(dāng)流速為0.5 mL/min 時(shí)，酒石酸、蘋果酸和檸檬酸的保留時(shí)間分別為2.53、2.97、3.88 min，隨著流速的增加，保留時(shí)間降低，且酒石酸和蘋果酸的吸收峰發(fā)生重疊；當(dāng)增加到0.8 mL/min 時(shí)，3 種有機(jī)酸的出峰時(shí)間明顯提前.這表明流動(dòng)相的流速過(guò)大會(huì)導(dǎo)致各物質(zhì)的吸收峰重疊在一起，不能實(shí)現(xiàn)很好的分離，流速過(guò)低會(huì)使分析時(shí)間延長(zhǎng)，綜合考慮，流動(dòng)相的速度選擇為0.5 mL/min.

由于有機(jī)酸可與色譜柱固定相中殘留的硅羥基相互作用，出現(xiàn)峰型拖尾變寬的現(xiàn)象.使用磷酸-磷酸氫二銨緩沖鹽體系作為流動(dòng)相時(shí)可改善峰型，當(dāng)其pH 值在2.5～3.2 之間，可有效抑制有機(jī)酸中羧基離子的電離，減弱有機(jī)酸與硅羥基的相互作用.在檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm、進(jìn)樣量10 μL、甲醇-磷酸鹽緩沖液（V/V=3∶97）、柱溫30 ℃、流速0.5 mL/min 條件下，分別用pH 值為2.5、2.8、3.0、3.2的甲醇-磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相，考察流動(dòng)相的最佳pH 值.結(jié)果表明，在4 種pH 值條件下，混合標(biāo)樣中的酒石酸、蘋果酸和檸檬酸的分離效果相當(dāng)，考慮到所用色譜柱（Agilent Eclipse XDB-C18）的pH 值適用范圍是2～9，最佳適用范圍是3～8，而流動(dòng)相的pH 值越低對(duì)儀器的損傷越大，故流動(dòng)相的pH 值定為3.2.

根據(jù)高效液相色譜理論，柱溫是影響柱效和分離度的主要原因之一.柱溫的升高可以使流動(dòng)相的黏度降低，同時(shí)使樹(shù)脂的傳質(zhì)效率提高.所以，在較高的流動(dòng)相流速下，升高柱溫可以保證混合物中各成分依然達(dá)到較好的分離效果.在檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm、流動(dòng)相pH 值為3.2，V（甲醇）∶V（磷酸氫二銨緩沖鹽）=3∶97 的條件下，依次將柱溫升高到20、25、30、35、40 ℃，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣分析.結(jié)果表明，在這一溫度范圍內(nèi)，酒石酸保留時(shí)間依次為2.46、2.45、2.53、2.48、2.46 min；蘋果酸的保留時(shí)間依次為2.89、2.84、2.97、2.88、2.85 min；檸檬酸的保留時(shí)間依次為3.81、3.60、3.88、3.53、3.42 min.當(dāng)柱溫升高時(shí)，酒石酸和蘋果酸的保留時(shí)間變化不大，而檸檬酸的保留時(shí)間隨柱溫的升高而提前.且柱溫為40 ℃時(shí)，混標(biāo)中檸檬酸的色譜峰變寬，峰形不夠尖銳.在同等的分離效果的情況下，綜合對(duì)柱子性能的保護(hù)和對(duì)分離效率及柱效的考慮，選擇柱溫30 ℃作為色譜分離條件.

綜上所述，選定的有機(jī)酸最佳分離條件為：檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30 ℃，流動(dòng)相3∶97（V/V）的甲醇-磷酸氫二銨緩沖鹽溶液（pH=3.2），流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL.在此分離條件下，將3 種有機(jī)酸混標(biāo)進(jìn)樣分析，由圖3 可見(jiàn)，3 種有機(jī)酸達(dá)到了很好的分離效果.

2.2.2 有機(jī)酸的定量工作曲線

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)酸液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed organic acids standards

將不同濃度的混合有機(jī)酸標(biāo)樣，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾到色譜瓶中，濃度從低到高依次進(jìn)樣，平行進(jìn)樣5 次，記錄各自的峰面積，以濃度對(duì)平均峰面積進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用外標(biāo)法對(duì)3 種有機(jī)酸進(jìn)行定量.其線性擬合方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3.酒石酸在0.019 8～0.198 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)，其濃度與峰面積呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.997 3，線性關(guān)系良好.蘋果酸和檸檬酸的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 0、0.997 7，在待測(cè)樣品濃度范圍內(nèi)，兩種有機(jī)酸都能保持良好的線性關(guān)系，可以保證外標(biāo)法定量的準(zhǔn)確性.

表3 各種有機(jī)酸的峰面積回歸分析Table 3 Regression analysis of organic acids

2.2.3 HPLC 的精密度與重復(fù)性

取同一混合標(biāo)樣平行測(cè)定5 次（每隔2 h 進(jìn)一次樣），測(cè)定其保留時(shí)間及峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），以峰面積的RSD 及保留時(shí)間的RSD對(duì)儀器的精密度進(jìn)行考察，其結(jié)果如表4 所示.3種有機(jī)酸保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.11%～0.18%范圍內(nèi)，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.11%～1.85%之間，表明在確定的色譜條件下，保留時(shí)間與峰面積基本恒定，本方法具有較高的精密度.

以無(wú)核白雞心為例，采用相同的提取方法平行5 次試驗(yàn)，分別進(jìn)行液相色譜分析，以考察方法的重現(xiàn)性.測(cè)得無(wú)核白雞心中酒石酸、蘋果酸、檸檬酸的平均含量分別為5.08%、0.71%、0.32%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.68%、2.65%和2.04%，該方法重現(xiàn)性較好.

2.2.4 方法的加標(biāo)回收率

稱取無(wú)核白雞心20.00 g，準(zhǔn)確加入1.01 g 酒石酸、0.14 g 蘋果酸和0.06 g 檸檬酸（加入量近似為葡萄干樣品中3 種酸含量的50%），采用相同的提取方法平行5 次試驗(yàn)，分別進(jìn)行液相色譜分析.測(cè)得酒石酸、蘋果酸、檸檬酸的平均回收率分別為96.54%、96.28%和102.30%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.98%、2.36%和4.32%，表明該方法定量分析葡萄干中3 種主要有機(jī)酸的準(zhǔn)確度較高.

表4 有機(jī)酸保留時(shí)間及峰面積的重現(xiàn)性Table 4 Reproducibility of retention time and peak area of organic acids

2.2.5 8 種葡萄干中有機(jī)酸的定量分析

分別取8 種葡萄干樣品，按照確定的提取方法制備浸膏，采用優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)樣分析（平行進(jìn)樣5 次），用外標(biāo)法測(cè)定3 種有機(jī)酸的含量.以無(wú)核白雞心為例，其色譜圖如圖4 所示.8 種葡萄干樣品的有機(jī)酸定量分析結(jié)果見(jiàn)表5.

從表5 可以看出，8 種葡萄干中均含有酒石酸、蘋果酸和檸檬酸.其中，酒石酸含量最高，蘋果酸和檸檬酸的含量相對(duì)較低.在同一品種葡萄干中有機(jī)酸的含量高低均表現(xiàn)為酒石酸＞蘋果酸＞檸檬酸.在8 種葡萄干中，酒石酸含量最高的是無(wú)核白（5.66%），最低的是木納格（2.36%）；蘋果酸含量最高的是馬奶子（0.79%），最低的是索索（0.19%）；檸檬酸含量最高的是馬奶子（0.65%），最低的是索索（0.10%）.3 種有機(jī)酸含量總和最高的是馬奶子（6.83%），最低的是木納格（2.75%）.

圖4 無(wú)核白雞心有機(jī)酸色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of organic acids in Centennial Seedless

表5 不同品種葡萄干中有機(jī)酸含量Table 5 The contents of organic acids in different raisins %

3 結(jié)論

通過(guò)GC-MS 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，從8 種葡萄干中共檢測(cè)出17 種有機(jī)酸，單一品種中最多可檢測(cè)出14 種有機(jī)酸，最少可檢測(cè)出8 種有機(jī)酸.由于原材料品種及晾曬方式的差別，8 種葡萄干中所含有機(jī)酸的種類有較大差別，其共有的有機(jī)酸為乙酰丙酸、DL-蘋果酸、L-（+）-酒石酸、檸檬酸和十六碳酸.采用Agilent Eclipse XDB-C18（4.6×150 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇-0.01 mol/L 磷酸氫二銨-磷酸緩沖鹽溶液（pH 3.2，體積比3∶97）為流動(dòng)相，在流速0.5 mL/min、波長(zhǎng)210 nm 條件下可較好地測(cè)定葡萄干中的有機(jī)酸含量.8 種葡萄干的定量測(cè)定結(jié)果表明，葡萄干中富含酒石酸、蘋果酸、檸檬酸等，其含量各不相同，但總體而言，酒石酸在各品種葡萄干的有機(jī)酸含量中均占主導(dǎo)地位，其次是蘋果酸，含量最少的是檸檬酸，這一結(jié)果也與相關(guān)報(bào)道相一致.酒石酸含量從高到低的品種順序是：無(wú)核白、索索、巨峰、無(wú)核白雞心、馬奶子、無(wú)核紫、和田紅和木納格.

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