高壓熱水-酶法分段提取香菇多糖的研究

王文文，譚才鄧，吳亞麗，劉嘉俊，湯敬謙，鄧毛程

（1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300；2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東 廣州 510300；3.暨南大學(xué) 圖書館，廣東 廣州 510632）

0 引言

香菇是世界第二大食用菌，也是我國特產(chǎn)之一，在民間素有“山珍”之稱，是高蛋白、低脂肪的營養(yǎng)保健食品.香菇中的香菇多糖是典型的T 細(xì)胞激活劑，能促進(jìn)人體內(nèi)細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，提高CTL 的殺傷活力，增強(qiáng)人體免疫功能[1].香菇多糖對多種腫瘤具有顯著抑制作用，對化學(xué)致癌、病毒致癌也有抑制作用[2-3].此外，香菇多糖還具有降血脂、抗氧化、降血糖等多種功能[4-6].隨著生活水平的提高，人們的保健意識在逐漸增強(qiáng)，將功能性多糖作為保健品來進(jìn)行開發(fā)，也越來越受到食品行業(yè)的重視[7].

目前，多糖的提取方法主要有熱水浸提法、超聲波提取法、稀酸稀堿浸提法、微波提取法、酶解法等幾種方法[8-11].香菇中含有大量的纖維素、果膠、蛋白質(zhì)等非多糖類大分子物質(zhì)，形成致密的結(jié)構(gòu)，阻礙了多糖在提取過程中的釋放.因此，人們利用纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶等復(fù)合酶對香菇進(jìn)行處理，以破壞非多糖類物質(zhì)，使香菇多糖更好地釋放出來[12].不同的酶作用條件不一樣，不同酶的組合對多糖的提取率亦不同，作者首次綜合運用高壓熱水、纖維素酶、果膠酶及菠蘿蛋白酶三酶分段法提取香菇多糖，使各種酶活力得到充分發(fā)揮，以最大程度提高香菇多糖提取率和提取質(zhì)量，從而為多糖的綜合應(yīng)用提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

香菇：購自西亞興安超市.

纖維素酶（10 000 U/g）、菠蘿蛋白酶（50 萬U/g）、果膠酶（40 U/mg）：南寧龐博生物工程公司.

DNS 試劑、無水乙醇、無水葡萄糖、氫氧化鈉、濃鹽酸、濃硫酸、苯酚等均為分析純.

1.2 主要儀器和設(shè)備[13]

DMF-10A 型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)：廣州市旭郎機(jī)械設(shè)備有限公司；DK-S26 型電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；S22PC 型可見光分光光度計：上海凌光技術(shù)有限公司；臺式低速離心機(jī)（中佳-SC-3614）：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平（BSA-224S-CW）：北京賽多利斯天平有限公司；雷磁酸度計（PHS-3C）：上海雷磁儀器廠.

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備將香菇子實體切碎片，旋風(fēng)式微型高速樣品粉碎機(jī)粉碎，過100 目篩，得香菇粉，備用.

1.3.2 香菇多糖的高壓熱水浸提

準(zhǔn)確稱取10.000 g 香菇干粉，加入200 mL 水于115 ℃下提取80 min，提取液冷卻至室溫，即為香菇多糖浸提液.在上述粗提液中，加入無水乙醇600 mL，使溶液乙醇濃度為75%左右，靜置30 min，6 000 r/min 離心20 min，收集沉淀；再用無水乙醇重懸沉淀，6 000 r/min 離心20 min，即得粗多糖樣品.

1.3.3 酶法提取香菇多糖

準(zhǔn)確稱取5.000 g 香菇干粉，放入400 mL 的燒杯中，燒杯中加入100 mL 水，置于滅菌鍋中高壓加熱浸提，提取條件為115 ℃、80 min.提取結(jié)束后，分別從酶濃度、pH、溫度、時間4 個方面研究纖維素酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶的最佳作用條件，再設(shè)計正交試驗研究最大影響因素，確定最佳工藝條件.

1.3.4 高壓熱水-酶法分段提取香菇多糖

首先用高壓熱水對香菇干粉進(jìn)行浸提，冷卻至室溫后，在上述優(yōu)化的每種酶的最佳條件下依次用纖維酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶對香菇浸提液進(jìn)行處理，提取香菇多糖，計算多糖得率.以單獨采用高壓熱水浸提法的結(jié)果作為對照.

1.3.5 正交試驗設(shè)計

以纖維素酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，選出溫度、pH、酶濃度、時間4 個因素，設(shè)計L9（34）正交試驗，并進(jìn)行驗證試驗，以香菇多糖的提取率為目標(biāo)測定值，通過極差分析，確定各種酶的最大影響因素及最佳提取工藝組合.

1.3.6 多糖提取率的測定

硫酸-苯酚法測定總糖含量，測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

式中：Y 為吸光值；X 為葡萄糖的含量，μg/mL；r=0.996 2.

DNS 法測定還原糖含量，測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

式中：Y 為吸光值；X 為葡萄糖的含量，μg/mL；r=0.997 9.

多糖含量=總糖含量-還原糖含量.

粗多糖提取率=多糖含量/子實體干質(zhì)量×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶提取香菇多糖單因素試驗

2.1.1 纖維素酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶濃度對香菇多糖提取率的影響（圖1）

由圖1 可知，在一定范圍內(nèi)，隨著酶濃度的增加，香菇多糖的提取率逐漸增加，而超過一定酶濃度，香菇多糖的提取率反而下降.推測是由于酶濃度過高出現(xiàn)反饋抑制或者酶影響了多糖的結(jié)構(gòu)，而導(dǎo)致多糖提取率下降.因此，選擇纖維素酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶的合適濃度分別為2%、1.0%、1.5%.

圖1 酶濃度對香菇多糖提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme concentration on the extraction rate of lentinan

2.1.2 pH 對纖維素酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶提取香菇多糖的影響

不同風(fēng)門開度下的橫向配風(fēng)不均勻系數(shù)模擬結(jié)果如圖11所示。增加風(fēng)室進(jìn)口風(fēng)門開度，減小尾部風(fēng)門開度可以很大程度降低爐排橫向配風(fēng)不均勻系數(shù)。通過對比各種工況可以得出：此鏈條爐排在布置擋板以后最佳風(fēng)門開度(從風(fēng)室進(jìn)口到尾部)依次為100%、70%、50%、50%、50%，其配風(fēng)不均勻系數(shù)為7%，與風(fēng)門全開時相比降低了69.5%。

pH 對酶提取香菇多糖的影響見圖2.pH 過高或過低都會破壞酶的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響香菇多糖提取率.由圖2 可知，3 種酶的最適pH 分別為纖維素酶5.5、果膠酶5、菠蘿蛋白酶4.

圖2 pH 對酶提取香菇多糖的影響Fig.2 Effect of pH on the enzyme extraction rate of lentinan

2.1.3 溫度對纖維素酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶提取香菇多糖的影響

溫度對酶提取香菇多糖的影響見圖3.由圖3可知，3 種酶趨勢一致，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，由于酶活力提高，提取率也逐漸增加，但超過酶的最適溫度，提取率反而下降.纖維素酶的合適溫度為40 ℃，果膠酶的合適溫度為40 ℃，而菠蘿蛋白酶的合適溫度為55 ℃.

圖3 溫度對酶提取香菇多糖的影響Fig.3 Effect of temperature on the enzyme extraction rate of lentinan

2.1.4 時間對纖維素酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶提取香菇多糖的影響

時間對酶提取香菇多糖提取率的影響見圖4，適當(dāng)延長時間可增加提取率，但時間過長，酶活力下降，提取率不再增加，時間過短，酶活力沒得到充分發(fā)揮，香菇多糖的提取率也不高.由圖4 可知，纖維素酶的合適提取時間為0.5 h，果膠酶為2 h，菠蘿蛋白酶為2 h.

圖4 時間對酶提取香菇多糖的影響Fig.4 Effect of time on the enzyme extraction rate of lentinan

2.2 纖維素酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶正交試驗研究

2.2.1 纖維素酶提取香菇多糖工藝優(yōu)化

纖維素酶的正交試驗因素與水平見表1.正交試驗結(jié)果分析見表2，方差分析見表3.

表1 纖維素酶的正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of cellulase

表2 纖維素酶正交試驗結(jié)果分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment of cellulase

表3 纖維素酶正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment of cellulase

2.2.2 果膠酶提取香菇多糖工藝優(yōu)化

果膠酶的正交試驗因素與水平見表4.正交試驗結(jié)果分析見表5，方差分析見表6.

由表5 和表6 可以看出，影響因素依次為A＞B＞D＞C，即A 在0.1 水平下顯著.由此確定最佳提取工藝為A2B3C2D2，而正交表格中并未出現(xiàn)此組合，因此進(jìn)行驗證試驗.在A2B3C2D2條件下香菇多糖的提取率為3.19%，低于正交試驗中的3.39%，因此確定最佳組合為A2B3C1D2，即在溫度40 ℃、pH 4.5、酶濃度1.0%、時間1.5 h 的條件下，香菇多糖的提取率最高，為3.39%.

表4 果膠酶的正交試驗因素與水平Table 4 Factors and levels of orthogonal experiment of pectinase

表5 果膠酶正交試驗結(jié)果分析Table 5 Analysis of orthogonal experiment of pectinase

表6 果膠酶正交試驗方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment of pectinase

2.2.3 菠蘿蛋白酶提取香菇多糖工藝優(yōu)化

菠蘿蛋白酶的正交試驗因素與水平見表7.正交試驗結(jié)果分析見表8，方差分析見表9.

表7 菠蘿蛋白酶的正交試驗因素與水平Table 7 Factors and levels of orthogonal experiment of bromelain

由表8 和表9 可以看出，影響因素依次為C＞D＞B＞A，即C 在0.1 水平下顯著.由此確定最佳提取工藝為A3B1C1D3，而正交表格中并未出現(xiàn)此組合，因此進(jìn)行驗證試驗.在A3B1C1D3條件下香菇多糖的提取率為2.65%，高于正交試驗中的2.59%，因此確定最佳組合為A3B1C1D3，即在溫度60 ℃、pH 3.5、酶濃度1.0%、時間3.5 h 的條件下，香菇多糖的提取率最高，為2.65%.

表8 菠蘿蛋白酶正交試驗結(jié)果分析Table 8 Analysis of orthogonal experiment of bromelain

表9 菠蘿蛋白酶正交試驗方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal experiment of bromelain

2.2 不同方案提取香菇粗多糖提取率對比分析

為獲得較好的香菇多糖提取率，設(shè)計了5 種提取方案，其中以高壓熱水提取作為參照.由圖5 可知，在5 種方案中，高壓熱水-酶分段提起香菇多糖提取率最高，其次為高壓熱水-纖維素酶提取法.

圖5 香菇多糖不同提取方案提取率對比Fig.5 The extraction rate compatison for different extraction method of lentinan

3 結(jié)論

本研究的主要目的是對香菇多糖提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，以提高多糖提取率和產(chǎn)品質(zhì)量.其改進(jìn)主要表現(xiàn)在纖維素酶、果膠酶與菠蘿蛋白酶酶解提取與高壓熱水浸提綜合運用，以增加提取率和提取純度.選用料水比為1∶20，先進(jìn)行單因素試驗，再進(jìn)行正交試驗，研究最佳提取工藝高壓熱水協(xié)同纖維素酶最佳提取工藝為溫度40 ℃、pH 5.5、酶濃度2.0%、時間0.5 h，在此條件下，香菇多糖的提取率為4.16%.高壓熱水協(xié)同果膠酶最佳提取工藝為果膠酶濃度1.0%、時間1.5 h、溫度40 ℃、pH 4.5，在此條件下，香菇多糖的提取率可達(dá)3.39%；高壓熱水協(xié)同菠蘿蛋白酶提取香菇多糖最佳工藝溫度60 ℃、pH 3.5、酶濃度1.0%、時間3.5 h，在此條件下，香菇多糖的提取率為2.65%、高壓熱水→纖維素酶→果膠酶→菠蘿蛋白酶分段提取香菇多糖，香菇多糖的提取率高達(dá)5.27%，分別比高壓熱水、高壓熱水-纖維素酶、高壓熱水-果膠酶、高壓熱水-菠蘿蛋白酶方案提高了101.15%、26.68%、55.46%、98.87%，在5 種提取方案中提取率最高.因此，選定高壓熱水-酶分段法提取香菇多糖作為今后的提取方案，進(jìn)而繼續(xù)對香菇多糖的綜合應(yīng)用開展深入研究.

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