響應(yīng)面法優(yōu)化玉米芯預(yù)處理及酶解工藝的研究

楊盛茹，侯麗芬，丁長河，馬永生

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品系，河南 鄭州 450044；2.鄭州旅游職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 450009；3.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

第一代乙醇燃料由于以糧食作物為原料，被烙上“與人爭食，與糧爭地”的標(biāo)簽，現(xiàn)逐漸向以木質(zhì)纖維素為生產(chǎn)原料的纖維素乙醇即第二代乙醇燃料發(fā)展[1].

在我國玉米是僅次于小麥的主要糧食作物，其種植面積居世界第二位[2]，據(jù)中國國家統(tǒng)計局發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2014 年中國玉米產(chǎn)量為2.156 7 億t，其加工副產(chǎn)物玉米芯年產(chǎn)量約為0.719 億t.目前我國對玉米芯的加工使用比較少，大部分作為農(nóng)家燃料直接被燒掉，造成環(huán)境污染和資源的極大浪費(fèi)[3].

玉米芯主要由半纖維素、纖維素、木質(zhì)素等構(gòu)成，只有分解為可發(fā)酵性糖才可以轉(zhuǎn)化為乙醇燃料.由于半纖維素、木質(zhì)素對纖維素的包裹作用以及結(jié)晶纖維素本身復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，需對其進(jìn)行一定的預(yù)處理以利于酶與底物反應(yīng)，從而提高酶解速度和增加糖轉(zhuǎn)化率[4].原料預(yù)處理工藝是木質(zhì)纖維素原料資源利用最大化實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵，對整個生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性有重大影響[5].研究證明，經(jīng)石灰預(yù)處理的原料殘?jiān)泻械拇罅繗溲趸}，與二氧化碳反應(yīng)，生成的碳酸鈣可用作飼料起到補(bǔ)鈣的功效[6].

本研究利用氧化鈣處理玉米芯，通過響應(yīng)面法對預(yù)處理、酶解轉(zhuǎn)化還原糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，為玉米芯資源的開發(fā)利用提供依據(jù)，具有重要的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米芯：無雜質(zhì)、無霉變，產(chǎn)自鄭州，晾曬干燥、粉碎過篩（直徑4 mm）后存放備用.

氧化鈣：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.

纖維素酶（10 000 U）、半纖維素酶（10 000 U）：肇東日程酶制劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A：上海亞榮生化儀器廠；色譜柱：Waters Carbohydrate High Performance 4 μm×4.6 mm×250 mm；高效液相色譜：Waters 2695（配2420 蒸發(fā)光散射檢測器和Empower Pro工作站）.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 還原糖含量測定方法

酶解液中還原糖主要由葡萄糖、木糖組成，采用高效液相色譜（HPLC）法測定還原糖含量[7].

配制葡萄糖、木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過濾膜（0.22 μm）后用于HPLC 測定分析.

配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取0.50 g、1.00 g、1.25 g、1.50 g 和2.00 g 葡萄糖于容量瓶（100 mL）中，加水定容.

配制木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別稱取0.25 g、0.50 g、0.75 g、1.00 g 和1.25 g 木糖于容量瓶（100 mL）中，加水定容.

色譜分析操作參數(shù)如下.柱溫：35 ℃；檢測器溫度：80 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；氮?dú)鈮毫Γ?5 PSI；流動相：乙腈/水，75/25（V/V）.

1.3.2 氧化鈣法預(yù)處理、酶解玉米芯工藝單因素試驗(yàn)

以氧化鈣含量、浸泡時間、預(yù)處理時間、加酶量、酶解時間等進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定影響玉米芯還原糖轉(zhuǎn)化的適宜條件.

1.3.2.1 氧化鈣含量的確定

稱6 份玉米芯（4.00 g）于三角瓶（250 mL）中，按每克玉米芯依次添加0、25、50、75、100、125 mg氧化鈣，分別加水（60 mL）混勻、45 ℃浸泡18 h、高溫（121 ℃）處理1 h，然后調(diào)pH4.5，加入纖維素酶和半纖維素酶（固形物含量的5%，1∶1）于130 r/min、45 ℃的條件下水解72 h，以5 000 r/min 離心10 min，取上清液測還原糖含量.

1.3.2.2 浸泡時間的確定

稱取6 份玉米芯（4.00 g）于三角瓶（250 mL）中，每克玉米芯添加100 mg 氧化鈣，加水（60 mL）混勻、45 ℃分別浸泡0、6、12、18、24、30 h，高溫（121 ℃）處理1 h，然后調(diào)pH4.5，加入纖維素酶和半纖維素酶（固形物含量的5%，1∶1）于130 r/min、45 ℃的條件下水解72 h，以5 000 r/min 離心10 min，取上清液測還原糖含量.

1.3.2.3 預(yù)處理時間的確定

稱取6 份玉米芯（4.00 g）于三角瓶（250 mL）中，每克玉米芯添加100 mg 氧化鈣，加水（60 mL）混勻、45 ℃浸泡18 h，高溫（121 ℃）分別處理0、15、30、45、60、75 min，然后調(diào)pH4.5，加入纖維素酶和半纖維素酶（固形物含量的5%，1∶1）于130 r/min、45 ℃的條件下水解72 h，以5 000 r/min 離心10 min，取上清液測還原糖含量.

1.3.2.4 加酶量的確定

稱取9 份玉米芯（4.00 g）于三角瓶（250 mL）中，每克玉米芯添加100 mg 氧化鈣，加水（60 mL）混勻、45 ℃浸泡18 h、高溫（121 ℃）處理1 h，然后調(diào)pH4.5，分別以固形物含量的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%加入纖維素酶和半纖維素酶（1∶1），于130 r/min、45 ℃的條件下水解72 h，以5 000 r/min 離心10 min，取上清液測還原糖含量.

1.3.2.5 酶解時間的確定

稱取8 份玉米芯（4.00 g）于三角瓶（250 mL）中，每克玉米芯添加100 mg 氧化鈣，加水（60 mL）混勻、45 ℃浸泡18 h、高溫（121 ℃）處理1 h，后調(diào)pH4.5，加入纖維素酶和半纖維素酶（固形物含量的5%，1∶1）于130 r/min、45 ℃的條件下分別水解12、24、36、48、60、72、84、96 h，以5 000 r/min 離心10 min，取上清液測還原糖含量.

1.3.3 預(yù)處理、酶解工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 7.0 軟件，以還原糖轉(zhuǎn)化量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面曲面分析[8]，對玉米芯預(yù)處理、酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化.

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化鈣法預(yù)處理、酶解玉米芯工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 氧化鈣含量對還原糖轉(zhuǎn)化量的影響（圖1）

圖1 氧化鈣含量對葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化量的影響Fig.1 Effect of calcium oxide content on the conversion amount of glucose and xylose

從圖1 可以看出，氧化鈣加入量為0 mg/g 時，酶解液中葡萄糖和木糖含量最低；隨著氧化鈣加入量逐漸增大，葡萄糖、木糖轉(zhuǎn)化量均明顯增加，分別在氧化鈣含量為75 mg/g、50 mg/g 時達(dá)到最大值，之后均有降低趨勢.稀堿溶液中木質(zhì)素和其他成分之間發(fā)生酯鍵皂化作用[9]，降低纖維素結(jié)晶度，增加原料多孔性，利于后續(xù)酶解，但加入氧化鈣量過高，產(chǎn)物還原糖的積累對纖維素酶、半纖維素酶有抑制作用[10]，也會造成二者轉(zhuǎn)化量降低.考慮總還原糖轉(zhuǎn)化量，試驗(yàn)中選定氧化鈣加入量為50 mg/g.

2.1.2 浸泡時間對還原糖轉(zhuǎn)化量的影響（圖2）

圖2 浸泡時間對葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化量的影響Fig.2 Effect of maceration time on the conversion amount of glucose and xylose

由圖2 可知，在一定時間范圍內(nèi)，原料中還原糖降解量增加，酶解液中木糖、葡萄糖含量隨浸泡時間延長而增大，當(dāng)浸泡時間大于18 h 時總還原糖轉(zhuǎn)化量并無顯著增加，葡萄糖含量維持在130 mg/g 左右，木糖含量維持在115 mg/g 左右，所以選定浸泡時間為18 h.

2.1.3 預(yù)處理時間對還原糖轉(zhuǎn)化量的影響（圖3）

圖3 預(yù)處理時間對葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化量的影響Fig.3 Effect of pretreatment time on the conversion amount of glucose and xylose

從圖3 可以看出，高溫下處理玉米芯，其酶解液中葡萄糖和木糖的含量隨著處理時間延長均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，處理45 min 時木糖轉(zhuǎn)化量接近于最大值，葡萄糖達(dá)到最大值145.6 mg/g.由于121 ℃下處理時間較長，糖類被分解為其他物質(zhì)使得總還原糖含量降低[11]，所以試驗(yàn)中確定預(yù)處理45 min.

2.1.4 加酶量對還原糖轉(zhuǎn)化量的影響（圖4）

圖4 加酶量對葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化量的影響Fig.4 Effect of enzyme dosages on the conversion amount of glucose and xylose

由圖4 可知，加酶量不同，酶解液中葡萄糖、木糖含量均有顯著變化.當(dāng)加酶量低于7%時增加加酶量，二者都呈現(xiàn)明顯上升趨勢，其中葡萄糖含量增加尤為明顯.當(dāng)加酶量高于7%時，可能是纖維素酶、半纖維素酶與底物逐漸結(jié)合[12]，還原糖轉(zhuǎn)化量增加平緩.由于酶用量增加會增大生產(chǎn)成本，試驗(yàn)中選定加酶量為7%.

2.1.5 酶解時間對還原糖轉(zhuǎn)化量的影響（圖5）

從圖5 可以看出，酶解時間較短時，酶解液中葡萄糖、木糖含量均隨酶解進(jìn)行逐漸增加，二者分別在60 h、72 h 時達(dá)到最大值，此后由于分解略有降低.考慮總還原糖轉(zhuǎn)化量，選定酶解時間72 h.

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取氧化鈣含量、加酶量和酶解時間設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表1、表2.

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

圖5 酶解時間對葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydration time on the conversion amount of glucose and xylose

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental Design and results of response surface analysis

將表2 的數(shù)據(jù)通過軟件Design-Expert 7.0 進(jìn)行分析，結(jié)果見表3.從表3 可知，加酶量(Prob＞F)＜0.05，酶解時間(Prob＞F)＜0.05，二者對還原糖轉(zhuǎn)化量影響顯著.以酶解液中總還原糖轉(zhuǎn)化量為響應(yīng)值，各因素經(jīng)回歸擬合得到回歸方程：

還原糖轉(zhuǎn)化量=364.65 +9.67A +14.25B +18.30C-51.26A2-2.20B2-9.14C2+6.60AB-31.44AC-1.13BC.

根據(jù)方差分析結(jié)果，模型F 值58.18，其Prob＞F=0.000 2，此值<0.05，極其顯著.差擬項(xiàng)檢驗(yàn)Prob＞F=0.166 3，此值＞0.05，不顯著.R2（決定系數(shù)）=0.990 0.表明此模型充分?jǐn)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)[13]，此回歸方程是玉米芯中還原糖轉(zhuǎn)化各參數(shù)的合適數(shù)學(xué)模型，可用此方程確定玉米芯中還原糖轉(zhuǎn)化的最佳預(yù)處理、酶解工藝.

根據(jù)回歸方程做出了氧化鈣含量、加酶量、酶解時間3 個試驗(yàn)因子的響應(yīng)面分析圖，圖6 是響應(yīng)值還原糖轉(zhuǎn)化量對3 個試驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，可直觀地看出各參數(shù)之間的相互作用和最佳參數(shù).由圖6 可看出，因素交互作用對還原糖轉(zhuǎn)化量的影響，曲線越陡峭表明此因素對還原糖轉(zhuǎn)化量影響越大，對應(yīng)響應(yīng)值的相應(yīng)變化.其中酶解時間對總還原糖轉(zhuǎn)化量影響最大，加酶量次之，酶解時間與氧化鈣含量間的交互作用有一定的顯著性，與表3 方差分析結(jié)果一致，酶解時間、加酶量和酶解時間與氧化鈣含量的交互作用三者對應(yīng)的Prob＞F 值均小于0.05，都達(dá)到顯著水平.

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

圖6 兩因素交互作用對還原糖轉(zhuǎn)化量的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of operating parameters on the conversion amount of glucose and xylose

回歸模型預(yù)測的預(yù)處理、酶解玉米芯轉(zhuǎn)化還原糖的最佳工藝為氧化鈣含量50.20 mg/g、加酶量8.00%、酶解時間80.36 h，還原糖轉(zhuǎn)化量理論值為384.18 mg/g.將工藝條件修正為氧化鈣含量50 mg/g、加酶量8%、酶解時間80 h 進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，還原糖轉(zhuǎn)化量為385.85 mg/g，與理論值基本一致，證明工藝參數(shù)合理可靠，具有實(shí)用價值.

3 結(jié)論

堿處理是一種有效、實(shí)用的化學(xué)方法，其中石灰因價格低廉成為研究堿處理法和實(shí)際應(yīng)用中的常用物質(zhì).以玉米芯為原料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對預(yù)處理、酶解工藝優(yōu)化，擬合了氧化鈣含量、加酶量、酶解時間這3 個因素對還原糖轉(zhuǎn)化量的回歸模型，分析研究因素顯著性和交互作用強(qiáng)弱，得出還原糖轉(zhuǎn)化的最佳工藝條件：氧化鈣含量50 mg/g，浸泡時間18 h，121 ℃處理45 min，加酶量8%，酶解時間80 h，還原糖轉(zhuǎn)化量為385.85 mg/g，為進(jìn)一步研究玉米芯中還原糖提供了研究基礎(chǔ).

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