以DNA 為靶標(biāo)的植物油檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

吳興泉，劉楷影，王貝貝，朱立娜，谷克仁

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

植物油脂具有豐富的多不飽和脂肪酸、維生素E、甾醇等成分，這些成分在一定程度上能夠很好地幫助預(yù)防冠心病、癌癥、高血壓、抑郁癥等疾病[1]，具有良好的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，此外，植物油脂在化學(xué)分析、藥品研發(fā)、化妝品合成等方面也具有很高的應(yīng)用價(jià)值[2].

目前，我國(guó)植物油脂產(chǎn)品良莠不齊，摻偽摻假現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，植物油脂的摻假現(xiàn)象主要有以下兩個(gè)方面，一是摻入低價(jià)位植物油，二是標(biāo)識(shí)混亂.例如，在植物油脂產(chǎn)品的地理產(chǎn)地、品種來(lái)源、制作方法、轉(zhuǎn)基因成分等方面進(jìn)行欺騙性標(biāo)識(shí).其中摻入低價(jià)位植物油造成的摻假現(xiàn)象最為普遍，比如，在橄欖油中摻入榛子油、扁桃仁油、玉米油、棕櫚油、葵花籽油[3]、大豆油、花生油、棉籽油等[4].盡管絕大多數(shù)的摻假情況不會(huì)對(duì)人們健康造成巨大威脅（例如低級(jí)橄欖油摻入高級(jí)橄欖油），但是個(gè)別油料作物的過(guò)敏原蛋白還是會(huì)對(duì)敏感人群造成威脅[5].摻雜現(xiàn)象也會(huì)給制造商帶來(lái)不公平競(jìng)爭(zhēng)，使消費(fèi)者不能做出公正抉擇.因此建立植物油脂的檢測(cè)監(jiān)控、追蹤溯源技術(shù)可有效保護(hù)消費(fèi)者和生產(chǎn)者的利益，防止摻偽摻假現(xiàn)象的發(fā)生.

過(guò)去的幾年時(shí)間里，許多不同的分析方法用于食品溯源，主要包括3 大類(lèi)，即色譜分析、光譜分析、DNA 為靶標(biāo)分子的生物學(xué)分析[6-9].其中DNA 為靶標(biāo)分子的分析方法具有很多優(yōu)點(diǎn)，例如靶標(biāo)分子DNA 耐保存、普遍存在，核酸序列穩(wěn)定（不會(huì)隨著種植環(huán)境的改變而改變）等.DNA 為靶標(biāo)的植物油脂檢測(cè)技術(shù)主要包括：常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、多重PCR、PCR-毛細(xì)管電泳-單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)（PCR-CE-SSCP）、PCR-高分辨率溶解曲線（PCR-HRM）[10-11]、核酸序列測(cè)定等技術(shù)，可以檢測(cè)植物油脂的油料種類(lèi)及同種油料的不同品種，以及是否為轉(zhuǎn)基因油脂等.作者總結(jié)了以DNA 為靶標(biāo)的植物油脂檢測(cè)技術(shù)中涉及到的DNA提取方法、植物油脂的油料種類(lèi)鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定以及油料品種溯源等技術(shù).

1 影響植物油DNA 提取及其檢測(cè)效果的因素

1.1 植物油脂精煉工藝影響DNA 的含量及完整性

水溶性的DNA 在植物油中的含量很少.植物油精煉過(guò)程對(duì)DNA 的破壞導(dǎo)致DNA 的含量較低、完整性較差.在隨后的儲(chǔ)藏過(guò)程中，DNA 含量以及完整性會(huì)進(jìn)一步遭到破壞.盡管壓榨型植物油（橄欖油、花生油、芝麻油等）中的DNA 含量相對(duì)較高，但總體含量仍然很低，因此植物油脂中DNA 的高效提取成為應(yīng)用以DNA 為靶標(biāo)進(jìn)行油脂檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵.一般增大待測(cè)植物油的用量、在DNA 提取之前增設(shè)富集過(guò)程等均可增加DNA 提取成功率[12].

1.2 植物油脂的儲(chǔ)存時(shí)間

隨著植物油儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，空氣氧化作用和核酸酶酶解作用都會(huì)破壞DNA 的含量以及完整性.為了獲得良好的檢測(cè)效果，待測(cè)的植物油越新鮮越好.Pafundo 等[13]依據(jù)儲(chǔ)藏時(shí)間（1 周、3 周、6個(gè)月、9 個(gè)月、一年、二年）的不同，通過(guò)毛細(xì)管電泳形象地將植物油及相應(yīng)葉片中DNA 的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)藏時(shí)間為6 個(gè)月、9 個(gè)月、一年、二年時(shí)，兩者在DNA 片段數(shù)量和大小方面都有明顯不同.當(dāng)植物油為新獲得樣品時(shí)，可以獲得很好的重復(fù)性.

1.3 DNA 的提取方法

現(xiàn)已報(bào)道的植物油脂DNA 提取方法有CTAB法、SDS 法和多種DNA 提取試劑盒法等.其中CTAB 法是傳統(tǒng)的提取方法，不斷有針對(duì)CTAB 法改進(jìn)修飾方法的產(chǎn)生，比如：CTAB-己烷法、CTAB-己烷-氯仿法等[14].上述方法各有優(yōu)缺點(diǎn)[15]，目前雖然已有很多DNA 的提取方法嘗試用于植物油中DNA 的提取，但是或多或少會(huì)有PCR 抑制物殘留，比如多糖、蛋白、酚等，因此在DNA 提取后，需要采用專(zhuān)門(mén)的DNA 純化試劑盒去除PCR 抑制物.

1.4 PCR 擴(kuò)增目標(biāo)DNA 片段的大小

經(jīng)過(guò)化學(xué)精煉過(guò)程的植物油，其含有的DNA完整性不強(qiáng)，后期PCR 檢測(cè)時(shí)如果擴(kuò)增片段較大往往會(huì)擴(kuò)增失敗.Costa 等[16]以大豆種屬特異性基因Lectin 基因?yàn)榘袠?biāo)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)GM03/GM04 引物（118 bp）在脫膠植物油中擴(kuò)增失敗，而LE1/LE2 引物（103 bp）卻有很好的擴(kuò)增效果.采用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）法檢測(cè)橄欖油時(shí)，儲(chǔ)存10 d 和20 d 的樣本，擴(kuò)增片段大小分別低于691 bp 和415 bp，而107 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有改變[13].如果采用SYBR qPCR 則擴(kuò)增80 bp DNA 片段的效果明顯好于擴(kuò)增200 bp 的DNA 片段.可見(jiàn)，針對(duì)油脂DNA 進(jìn)行分子標(biāo)記分析，使用較小片段作為靶標(biāo)更具優(yōu)勢(shì)[17].

2 以DNA 為靶標(biāo)的植物油脂檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用

2.1 植物油摻假檢測(cè)與鑒定

我國(guó)植物油脂市場(chǎng)中油脂品種很多，因營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不同價(jià)格差異很大，將低價(jià)位油脂摻入高價(jià)位油脂中的現(xiàn)象很普遍.如果能有效地檢測(cè)出混合油脂中的各種組分即可實(shí)現(xiàn)摻假油的鑒定.不同物種具有各自不同的基因序列（即DNA 序列），這種差異在物種間穩(wěn)定存在，不會(huì)因種植地域和環(huán)境條件的改變而受到影響，因此利用DNA為靶標(biāo)進(jìn)行植物油摻偽檢測(cè)將具有很大的應(yīng)用潛力.

2.1.1 鑒定方法

以DNA 為靶標(biāo)的摻假油脂的鑒定主要采用PCR 法擴(kuò)增各個(gè)油料作物的特定基因片段（靶基因序列），然后采用凝膠電泳、毛細(xì)管電泳等對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)[18-20].由于油料作物指紋圖譜與對(duì)應(yīng)植物油指紋圖譜的一致性以及種內(nèi)保守性，在進(jìn)行植物油摻假檢測(cè)時(shí)，可以依據(jù)指紋圖譜對(duì)應(yīng)不同的油料作物以證實(shí)“摻假”情況.如果采用熒光定量PCR(qPCR)[18]技術(shù)則需要依據(jù)擴(kuò)增曲線“產(chǎn)生與否”為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷.

2.1.2 應(yīng)用實(shí)例

楊冬燕等[4]分別以2∶1、1∶1、1∶1∶1 的比例將一種或兩種低價(jià)位油脂摻入一種高價(jià)位油脂中，以低價(jià)位油脂對(duì)應(yīng)的油料作物種屬特異性基因?yàn)榘袠?biāo)，通過(guò)普通PCR 及雙重PCR 擴(kuò)增后的電泳圖定性檢測(cè)摻偽現(xiàn)象.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低價(jià)位油脂摻入量的多少直接影響著檢出率，以2∶1 比例摻偽的檢出率最高.Spaniolas 等[19]、張海亮[20]分別依據(jù)葉綠體trnL 內(nèi)含子區(qū)域、rbcL 基因序列設(shè)計(jì)通用引物，利用這些通用引物擴(kuò)增常見(jiàn)油料作物靶基因，比如大豆、橄欖、芝麻、花生、玉米、葵花、菜籽、榛子、棉籽、鱷梨等，毛細(xì)管電泳結(jié)果顯示，依據(jù)指紋圖譜能夠?qū)⒔^大多數(shù)參試品種區(qū)分開(kāi).在區(qū)分鱷梨、芝麻與橄欖時(shí)，由于擴(kuò)增片段長(zhǎng)度相近，存在區(qū)分困難的情況，但借助SNP 位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，即可達(dá)到完全區(qū)分的效果.

2.1.3 靶基因的選擇

一般采用種屬特異性基因作為靶基因，需要滿足兩個(gè)條件：（1）該物種油料作物的所有品種均含有該基因；（2）其他物種油料作物不含有該基因或者說(shuō)不存在該基因的靶序列.例如花生種屬特異性基因有幾丁質(zhì)酶chi2.2 基因[21]、過(guò)敏原基因Arah1、Arah2、Arah3 等；大豆種屬特異性基因有l(wèi)ectin 基因；油菜種屬特異性基因有PEP 基因、HMG I/Y 基因；玉米種屬特異性基因有zSSⅡb 基因、ivrl 基因等.油料作物種屬特異性基因，還可以選擇葉綠體基因，因?yàn)檫@些基因序列中部分序列在同一物種內(nèi)進(jìn)化速度緩慢，比較保守，但是在不同物種間進(jìn)化速度較快，具有較高的種間差異性，可以用于不同物種的鑒定.

2.2 轉(zhuǎn)基因油脂的檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因油菜等油料作物因具有高油脂、抗蟲(chóng)、抗除草劑等特性[22]而被廣泛種植，并大量用于榨油行業(yè).為了保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)，有關(guān)組織頒布條例要求轉(zhuǎn)基因食品必須予以聲明.過(guò)去幾年，很多學(xué)者基于植物油精煉后，DNA 檢測(cè)不到或者檢測(cè)到的含量微小，錯(cuò)誤地認(rèn)為即使植物油中含有轉(zhuǎn)基因原料也不必標(biāo)識(shí).然而近幾年，隨著精煉植物油DNA 提取技術(shù)的成熟，DNA 提取質(zhì)量有了很大提升，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)也成為必不可少的部分.Costa 等[16]沿著原材料準(zhǔn)備、植物油提取、后期精煉等過(guò)程對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大豆內(nèi)標(biāo)基因在所有過(guò)程樣品中（包括精煉過(guò)程每個(gè)步驟）都能檢測(cè)到，轉(zhuǎn)基因成分在原油以及最終的精煉油中同樣能檢測(cè)到.

在轉(zhuǎn)基因大豆油檢測(cè)中，lectin 基因經(jīng)常作為內(nèi)源基因，抗除草劑基因EPSPS 作為外源基因.在進(jìn)行外源基因檢測(cè)之前，可結(jié)合轉(zhuǎn)基因作物的基因圖譜對(duì)調(diào)控基因（35 s 啟動(dòng)子基因以及T-nos 終止子基因）進(jìn)行檢測(cè)，此步驟被越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為是重要初篩步驟[23-24].

轉(zhuǎn)基因玉米的種類(lèi)很多，比如Bt11、MON863、MON810、Bt176、T25、GA21、TC1507 等，其中由孟山都公司研制的轉(zhuǎn)基因玉米MON863，被作為主要的轉(zhuǎn)基因玉米得以種植，其插入的Cry3Bb1 殺蟲(chóng)基因能夠編碼出來(lái)殺蟲(chóng)蛋白Cry3Bb1，該基因的檢測(cè)結(jié)果可以作為植物油原料是否含有轉(zhuǎn)基因玉米MON863 的判定標(biāo)準(zhǔn).如今，植物油轉(zhuǎn)基因原料檢測(cè)、物種鑒定等不再是學(xué)者們研究的難點(diǎn).

2.3 油脂的追蹤溯源技術(shù)

在植物油油料品種溯源鑒定中研究最多的是高價(jià)位橄欖油.對(duì)于特級(jí)初榨橄欖油而言，其原料品種很大程度上決定了油品質(zhì)量.由于橄欖的品種繁多[25]，橄欖油制備也從單一品種橄欖油向多品種橄欖油轉(zhuǎn)變.為了對(duì)橄欖油品種進(jìn)行規(guī)范，也為了使具有優(yōu)良性狀的品種得以延續(xù)和保護(hù)，歐盟相關(guān)組織對(duì)特定的橄欖油品種頒布了“原產(chǎn)地標(biāo)識(shí)PDO”和“地理標(biāo)識(shí)PGI”.只有具有“PDO”和“PGI”標(biāo)識(shí)的橄欖油品種才能用于制備橄欖油，對(duì)不具備保護(hù)標(biāo)識(shí)的橄欖油要進(jìn)行品種溯源鑒定.

在橄欖油品種溯源鑒定中應(yīng)用最多是DNA 標(biāo)記技術(shù)，主要有：AFLP、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(randomly amplified polymorphic DNAs，RAPDs)、微衛(wèi)星序列（microsatellites，SSRs）、單核苷酸多態(tài)性 (singlenucleotide polymorphisms，SNPs)等.

2.3.1 AFLP 技術(shù)的應(yīng)用

利用AFLP 技術(shù)不需要預(yù)先知道待擴(kuò)增基因的序列，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因位點(diǎn)同時(shí)擴(kuò)增，進(jìn)而可以在一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)增出來(lái)許多多態(tài)性條帶.Busconi 等[26]對(duì)Moraiolo、Taggiasca 兩個(gè)橄欖品種的葉片和橄欖油中的DNA 進(jìn)行AFLP 分析，毛細(xì)管電泳檢測(cè)證實(shí)，如果橄欖葉片與橄欖油來(lái)自不同品種，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)信號(hào)峰差別明顯；如果兩者為同一品種，則擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)信號(hào)峰具有高度一致性.Pafundo 等[27]進(jìn)一步利用AFLP 結(jié)合毛細(xì)管電泳對(duì)橄欖葉子以及橄欖油進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)兩者 AFLP 結(jié)果的一致性可以達(dá)到 70% .Montemurro 等[28]以10 個(gè)品種橄欖油為樣品，從6個(gè)AFLP 引物組合中篩選出來(lái)多態(tài)性指數(shù)（DI 值）最大的引物組合Pst-AGG/Mse-AGG，利用該引物組合擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，能夠?qū)⒃嚨乃衅贩N橄欖油區(qū)分開(kāi).分析發(fā)現(xiàn)葉子比油的擴(kuò)增條帶多是因?yàn)槿~子中DNA 遭到破壞的程度小，大于350 bp 的片段可以擴(kuò)增.

2.3.2 RAPD 技術(shù)的應(yīng)用

RAPD 的特點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、成本低、樣品需求量低等.Mohammad 等[29]使用15 個(gè)RAPD 引物對(duì)13 個(gè)約旦橄欖品種進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到156 個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶的比率為55%，多態(tài)性條帶中包含8 個(gè)品種特異性條帶.例如引物OPOX03-250 針對(duì)橄欖品種Souri 擴(kuò)增出來(lái)特異性條帶，該引物可以作為鑒定該品種的特異性引物，也可以使用該引物對(duì)該品種橄欖壓榨的橄欖油進(jìn)行鑒定.

2.3.3 SSR 技術(shù)的應(yīng)用

SSR 的特點(diǎn)在于具有高度的多態(tài)性.Rotondi等[30]利用13 個(gè)SSR 引物對(duì)13 個(gè)橄欖品種進(jìn)行擴(kuò)增，共得到72 個(gè)等位基因，其中引物DCA9 擴(kuò)增的等位基因數(shù)多達(dá)9 個(gè).也可以從SSR 引物中篩選出針對(duì)特定品種的引物，用于橄欖油品種鑒定.Pasqualone 等[31]使用橄欖Leucocarpa 品種的單一特異性SSR 引物GAPU103A 將Leucocarpa 橄欖油與參試的其他6 個(gè)單一品種的橄欖油完全區(qū)分開(kāi).其中GAPU103A 引物的PD 值較高，在Vittorio Alba等[32]實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)，同時(shí)后者篩選出來(lái)另一個(gè)多態(tài)性引物UD043A，其單獨(dú)使用同樣能夠?qū)⒃嚨? 個(gè)PDO 品種橄欖油區(qū)分開(kāi).

SSR 分析中不可避免地會(huì)遇到橄欖葉子和橄欖油DNA 擴(kuò)增結(jié)果不一致的部分，Doveri 等[33]結(jié)合凝膠電泳對(duì)葉子、果肉、胚芽、油等部位的DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)額外片段存在油、胚芽中，究其原因在于胚芽基因的混入，類(lèi)似的結(jié)果在Rayda 等[34-35]毛細(xì)管電泳分析中也得到證實(shí).鑒于胚芽基因可能會(huì)混入油脂中，在利用葉子DNA 擴(kuò)增結(jié)果鑒定油脂品種時(shí)，需要適當(dāng)注意排除胚芽基因的干擾.

2.3.4 SNP 技術(shù)的應(yīng)用

SNP 的特點(diǎn)在于普遍性、穩(wěn)定性，能夠?qū)⒒虿顒e很小的品種區(qū)分開(kāi).Consolandi 等[36]利用多重PCR 結(jié)合LDR-UA 對(duì)含有17 個(gè)SNP 位點(diǎn)的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，利用擴(kuò)增結(jié)果可區(qū)分8 個(gè)品種的橄欖油.

3 結(jié)論與展望

分析結(jié)果表明，以DNA 為靶標(biāo)的植物油檢測(cè)技術(shù)已在植物油摻假檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因植物油脂檢測(cè)、植物油油料品種追溯等方面取得了很好的應(yīng)用效果.目前，植物油脂中的DNA 提取方法已經(jīng)成熟，鑒于DNA 分子穩(wěn)定性高、不易受到環(huán)境中各種不利因素影響等優(yōu)勢(shì)，以DNA 為靶標(biāo)的植物油檢測(cè)技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景.

在植物油脂摻假鑒定技術(shù)中，目前主要是以不同油料作物的種屬特異性基因?yàn)榘袠?biāo)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后結(jié)合凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、熒光定量分析等手段進(jìn)行定性檢測(cè).轉(zhuǎn)基因原料摻入檢測(cè)涉及到內(nèi)源基因檢測(cè)、調(diào)控基因檢測(cè)、外源基因檢測(cè)，其中外源基因的檢測(cè)是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的核心.植物油的品種追溯主要是利用同一種油料不同品種間的特征性分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定.目前應(yīng)用的領(lǐng)域主要是橄欖油的分析，已經(jīng)取得了良好的應(yīng)用效果.但在其他油脂的品種追蹤溯源方面尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道，這應(yīng)該是今后植物油脂檢測(cè)鑒定技術(shù)的一個(gè)發(fā)展方向.

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