• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鬼點(diǎn)燈化學(xué)成分及抗結(jié)直腸癌活性研究

    2025-03-19 00:00:00趙小超柴玲林霄商勛葛竹妹萬(wàn)廣聞
    廣西植物 2025年2期
    關(guān)鍵詞:結(jié)構(gòu)鑒定化學(xué)成分

    摘 要:為探究鬼點(diǎn)燈(Bothriospermum zeylanicum)的抗結(jié)直腸癌活性成分,該研究采用ODS反相柱色譜、高壓制備液相色譜等方法對(duì)乙酸乙酯部進(jìn)行分離純化,通過(guò)質(zhì)譜及核磁共振等波譜分析鑒定化合物結(jié)構(gòu),并釆用CCK8法檢測(cè)化合物對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞(SW620、HT-29)及人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(NCM460) 增殖的影響。結(jié)果表明:(1)從鬼點(diǎn)燈乙酸乙酯部共分離得到12個(gè)化合物,分別鑒定為富馬酸(1)、原兒茶酸(2)、富馬酸單甲酯(3)、3,4,α-三羥基甲基苯丙酸酯(4)、對(duì)羥基苯甲酸(5)、echiumin A(6)、echiumin B(7)、(+)-異落葉松脂素-2a-O-β-D-葡萄糖苷(8)、對(duì)香豆酰-α-L-鼠李吡喃糖苷(9)、對(duì)香豆酸(10)、(-)-5′-甲氧基異落葉松脂醇-3α-O-β-D-葡萄糖苷(11)、rupestrin B(12)。化合物1-12均為首次從鬼點(diǎn)燈中分離得到。(2)化合物8和化合物12對(duì)SW620細(xì)胞增殖具有一定抑制作用,其IC50值分別為(9.34±1.10) μmol·L-1和(0.33±0.06) μmol·L-1,化合物12對(duì)HT-29細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用,其IC50值為(15.94±1.56) μmol·L-1。該研究結(jié)果豐富了鬼點(diǎn)燈的化學(xué)成分,進(jìn)一步明確了其抗結(jié)直腸癌活性成分,為鬼點(diǎn)燈的藥效開(kāi)發(fā)與利用提供了參考。

    關(guān)鍵詞:鬼點(diǎn)燈,化學(xué)成分,結(jié)構(gòu)鑒定,抗結(jié)直腸癌活性,乙酸乙酯部

    中圖分類號(hào):Q946

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

    文章編號(hào):1000-3142(2025)02-0328-09

    基金項(xiàng)目:2022年度“宿遷英才”群英計(jì)劃青年項(xiàng)目;宿遷市科技局自然科學(xué)基金青年科技人才項(xiàng)目(K202202);金華市科技局青年人才基金項(xiàng)目(2023KR03);廣西科技基地和人才專項(xiàng)(桂科AD17195002)。

    第一作者:趙小超(1988—),碩士,主管中藥師,主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理研究,(E-mail)515532094@qq.com。

    *通信作者:林霄,博士,研究員,主要從事海洋天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)及活性研究,(E-mail) linxiaolegend@163.com。

    Chemical constituents and anti-colorectal cancer activity of Bothriospermum zeylanicum

    ZHAO Xiaochao1,CHAI Ling2,LIN Xiao3*,SHANG Xun1,GE Zhumei1,WAN Guangwen1

    (1. Suqian Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Suqian 223800,Jiangsu,China; 2. Guangxi Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Standards,Nanning 530000,China; 3. Institute of Marine Medicine,Guangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanning 530000,China)

    Abstract:In order to explore the anti-colorectal cancer activity constituents of Bothriospermum zeylanicum,the compounds were isolated from the ethyl acetate fraction by ODS reversed phase column chromatography,high-pressure preparative liquid chromatography and other methods. MS,NMR and other spectroscopic were used to identify the structure of the compounds. And then the effects of the compounds on the proliferation of human colorectal cancer cells (SW620,HT-29) and human normal colon epithelial cells (NCM460) were detected by CCK8 method. The results were as follows:(1) A total of 12 compounds were identified from the ethyl acetate fraction of B. zeylanicum,including fumaric acid (1),protocatechuic acid (2),monomethyl fumarate (3),3,4,α-trihydroxymethylphenyl propionate (4),p-hydroxybenzoic acid (5),echiumin A (6),echiumin B (7),(+)-isolariciresinol-2a-O-β-D-glucopyranoside(8),p-coumaroyl-α-L-rhamnopyranoside (9),p-coumaric acid (10),(-)-5-methoxyisolariciresinol-3α-O-β-D-glucopyranoside (11),rupestrin B (12). Compounds 1-12 were isolated from B. zeylanicum for the first time. (2) Compounds 8 and 12 showed a certain inhibitory effect on the proliferation of SW620 cells,with IC50 values of(9.34±1.10) μmol·L-1 and(0.33±0.06) μmol·L-1,respectively. Compound 12 showed a certain inhibitory effect on the proliferation of HT-29 cells,with IC50 value of(15.94±1.56) μmol·L-1. This finding enriches the chemical constituents of B. zeylanicum,and it further clarifies its anti-colorectal cancer activity constituents and which provides a reference for the development and utilization of B. zeylanicum.

    Key words:Bothriospermum zeylanicum,chemical constituents,structure identification,anti-colorectal cancer activity,ethyl acetate fraction

    鬼點(diǎn)燈為紫草科植物柔弱斑種草(Bothriospermum zeylanicum)的干燥全草,全國(guó)各地均有分布,有小毒,具有止咳、止血的功效(國(guó)家中醫(yī)藥管理局編委會(huì),1999;蘇鈺嵐,2021),《民間常用草藥匯編》《中藥大辭典》等均有同樣的功效記載。中藥鬼點(diǎn)燈的臨床使用歷史較久,但其化學(xué)成分及藥理活性研究較少。紫草是現(xiàn)代研究較多的同科植物,其化學(xué)成分主要含有萘醌類、黃酮類、酚酸類、萜類、多糖類等,現(xiàn)代藥理研究表明其主要具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用(沈曉靜等,2023)。張梅等(2022)通過(guò)CCK8和Western blot等方法探究紫草素對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞(SW620、HT-29)增殖及凋亡的影響及其機(jī)制,發(fā)現(xiàn)紫草素具有明顯的抗結(jié)直腸癌活性,主要與鐵死亡有關(guān)。斑種草是其同屬植物,從其全株植物中分離出4種酚類化合物,即山萘酚、咖啡酸、山萘酚-3-O-β-3-O-p-D-吡喃葡萄糖苷和山萘酚-3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(Jang et al.,2003)。課題組前期僅通過(guò)GC-MS化學(xué)成分分析技術(shù)對(duì)其石油醚部進(jìn)行檢測(cè),共鑒定出33個(gè)成分,主要含有脂肪酸、脂肪醇及香豆素等類化合物,并通過(guò)DPPH和ABTS+自由基清除能力實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗氧化活性(趙小超等,2023),然而至今尚未見(jiàn)有鬼點(diǎn)燈具體化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理活性相關(guān)的研究報(bào)道。因此,為進(jìn)一步了解鬼點(diǎn)燈的化學(xué)成分,挖掘其抗結(jié)直腸癌活性,探究其活性物質(zhì),本研究以鬼點(diǎn)燈的干燥全草為研究對(duì)象,依托現(xiàn)代分離鑒定等技術(shù),采用重結(jié)晶、ODS反相柱色譜、高壓制備液相色譜、CCK8等方法,擬探討以下問(wèn)題:(1)鬼點(diǎn)燈乙酸乙酯部的化學(xué)成分;(2)所得獲得化合物對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    鬼點(diǎn)燈藥材采于江蘇省宿遷市宿豫區(qū)曹集鄉(xiāng)田間,經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院黃云峰研究員鑒定為紫草科植物柔弱斑種草(Bothriospermum zeylanicum)的全草。

    1.2 儀器

    核磁共振譜儀(Avance Ⅲ 500 MHz,Bruker公司,德國(guó));旋光儀(JASCO J-1500,JASCO公司,日本);超高效液相色譜儀-QDa檢測(cè)器(Acquity H-CLASS,Waters 公司,美國(guó));高效液相色譜儀(Prominence-LC-2030C 3D Plus,島津公司,日本);XBridge BEH Shield RP18制備型色譜柱(10 mm × 250 mm,5 μm);中壓制備色譜儀(Buchi公司,瑞士);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Eyelan-1100V-W型,東京理化株式會(huì)社,日本);高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3781L-PC,SANYO公司,日本);二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-170AICDL-PC,PHCBI公司,日本);超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2F,安泰空氣技術(shù)有限公司,蘇州);顯微鏡(ICX41,SDPTOP)、離心機(jī)(R-134a,Hitachi Koki公司,上海)。

    1.3 試劑

    細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)二甲基亞砜(DMSO,北京索萊寶科技有限公司);L-15 培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司);1640 培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、PBS(北京索萊寶科技有限公司);胎牛血清(上海達(dá)特希爾生物科技有限公司);CCK8檢測(cè)液(東仁化學(xué)科技有限公司);胰酶(賽默飛世爾科技公司);氘代試劑DMSO-d6、CD3OD(上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司);乙腈、甲醇為色譜純(廣東光華科技股份有限公司);人結(jié)直腸癌細(xì)胞 SW620、 HT-29及人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;其余化學(xué)試劑均為分析純。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 提取分離 鬼點(diǎn)燈地上部分2.5 kg,切碎后,經(jīng)甲醇冷浸提取3次,每次7 d,濾過(guò),提取液減壓濃縮至無(wú)醇味得總浸膏(200.3 g)??偨嗉铀鞈遥来斡檬兔?、乙酸乙酯、正丁醇萃取,回收溶劑,得到各萃取部位,其中石油醚萃取物(90.3 g)、乙酸乙酯萃取物(15.0 g)、正丁醇萃取物(23.5 g)。取乙酸乙酯部位(7.5 g)用反相ODS中壓色譜進(jìn)行分離,以甲醇-水(10%→100%)梯度洗脫,通過(guò)薄層色譜檢測(cè),合并得到20個(gè)流分。Fr. F重結(jié)晶后制得化合物BZC-2(1,50 mg);Fr. H經(jīng)反相ODS中壓色譜、高壓制備液相色譜得到化合物BZC-3(2,16.2 mg)、BZC-4(3,7.4 mg);Fr. J經(jīng)反相ODS中壓色譜、高壓制備液相色譜得到化合物BZC-5(4,6.1 mg)、BZC-6(5,14 mg);Fr. L經(jīng)反相ODS中壓色譜、高壓制備液相色譜得到化合物BZC-9(8,12 mg)、BZC-10(9,7.0 mg)、BZC-11(10,3.8 mg)、BZC-12(11,1.0 mg)、BZC-13(12,3.0 mg);Fr. M經(jīng)反相ODS中壓色譜、高壓制備液相色譜得到化合物BZC-7(6,11 mg)、BZC-8(7,30 mg)。

    1.4.2體外抗結(jié)直腸癌活性檢測(cè) 釆用CCK8法(Zheng et al.,2022)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。樣品用細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)DMSO溶解成10 mmol·L-1的母液,低溫保存,DMSO在最終體系中的濃度控制在不影響檢測(cè)活性的范圍之內(nèi),倍比稀釋為0.1~20 μmol· L-1的工作濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的上述癌細(xì)胞,用含10%小牛血清的L-15 (SW620)或RPMI-1640 (HT-29、NCM460)培養(yǎng)液,制成單細(xì)胞懸液每毫升1×106個(gè),將該懸液加到96孔板中,每孔加入100 μL。于5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,分別加入各濃度受試藥物(化合物6、7、8、12)和陽(yáng)性對(duì)照藥奧沙利鉑,使其終濃度分別為20、4、0.8、0.16、0.034 μmol·L-1,每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,陰性對(duì)照為等體積培養(yǎng)基及相應(yīng)的DMSO濃度為溶媒對(duì)照,以消除DMSO對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。于5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育72 h后,每孔加入10 μL CCK8溶液。孵育(37℃,5% CO2) 40~60 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下的吸光度值(OD)。將測(cè)得的OD值計(jì)算抑制率,并用Graphpad Prism 8軟件擬合化合物的IC50值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

    利用2.1方法對(duì)鬼點(diǎn)燈乙酸乙酯部位進(jìn)行分離純化,共獲得12個(gè)化合物,經(jīng)質(zhì)譜和核磁等波譜分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,化合物1-12的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

    化合物1 黃色塊狀晶體,ESI-MS m/z:117.0 [M+H]+(C4H5O4,理論值:117.08),分子式為C4H4O4。1H-NMR(500 MHz,CD3OD-d4)δ:6.76(2H,s,H-2,3);13C-NMR(126 MHz,CD3OD-d4)δ:166.68(C-1,4),133.77(C-2,3)。以上數(shù)據(jù)與田宇潔等(2013)報(bào)道的一致,故鑒定化合物1為富馬酸。

    化合物2 白色粉末,ESI-MS m/z:153.0 [M-H]-(C7H5O4,理論值:153.02),分子式為C7H6O41H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.31(1H,s,H-2),7.26(1H,d,J = 8.2 Hz,H-6),6.75(1H,d,J = 8.2 Hz,H-5);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:167.59(1-COOH),150.15(C-3),145.03(C-4),122.09(C-1),121.93(C-6),116.73(C-2),115.34(C-5)。以上數(shù)據(jù)與Ramadan等(2009)報(bào)道的一致,故鑒定化合物2為原兒茶酸。

    化合物3 白色粉末,ESI-MS m/z:131.0 [M+H]+(C5H7O4,理論值:131.03),分子式為C5H6O4。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:6.63~6.74(2H,m,H-2,3),3.73(3H,s,H-1′);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:165.9(C-1),165.2(C-4),135.4(C-3),131.4(C-2),52.2(C-1′)。以上數(shù)據(jù)與Ramadan等(2009)報(bào)道的一致,故鑒定化合物3為富馬酸單甲酯。

    化合物4 淡黃色無(wú)定形固體,ESI-MS m/z:213.1 [M+H]+(C10H13O5,理論值:213.08),分子式為C10H12O5。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:8.68(2H,s,3,4-OH),6.60(1H,d,J = 7.9 Hz,H-2),6.58(1H,d,J = 2.1 Hz,H-5),6.41(1H,dd,J = 8.0,2.1 Hz,H-6),5.46(1H,s,8-OH),4.12(1H,t,J = 6.3 Hz,H-8),3.59(3H,s,9-OCH3),2.74(1H,dd,J = 13.6,5.3 Hz,H-7α),2.63(1H,dd,J = 13.7,7.6 Hz,H-7β);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:174.06(C-9),144.81(C-3),143.73(C-4),128.25(C-1),119.99(C-6),116.78(C-2),115.27(C-5),71.70(C-8),51.32(C-7)。以上數(shù)據(jù)與Wang等(2000)報(bào)道的一致,故鑒定化合物4為3,4,α-三羥基甲基苯丙酸酯。

    化合物5 白色固體,ESI-MS m/z:139.0 [M+H]+(C7H7O3,理論值:139.04),分子式為C7H6O31H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.79(2H,d,J = 8.4 Hz,H-2,6),6.82(2H,d,J = 8.1 Hz,H-3,5);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:167.27(1-COOH),161.68(C-4),131.60(C-3,5),121.43(C-1),115.19(C-2,6)。以上數(shù)據(jù)與Li等(2004)報(bào)道的一致,故鑒定化合物5為對(duì)羥基苯甲酸。

    化合物6 無(wú)定形黃綠色粉末,[α]+96.3 (c 0.1,MeOH)。 ESI-MS m/z:1 037.3 [M+Na]+(C48H54O24Na,理論值:1 037.29),分子式為C48H54O241H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.78(1H,s,H-7),7.43(2H,d,J = 8.7 Hz,H-2″,H-6″),7.33(1H,d,J = 15.9 Hz,H-7″),7.07(1H,s,H-6),7.02(2H,d,J = 8.8 Hz,H-3″,H-5″),6.50(1H,d,J = 8.1 Hz,H-5′),6.48(1H,d,J = 2.1 Hz,H-2′),6.41(1H,dd,J = 8.2,2.1 Hz,H-6′),5.96(1H,d,J = 16.0 Hz,H-8″),5.44(1H,d,J = 1.8 Hz,H-1c),5.23(1H,d,J = 3.6 Hz,H-1b),4.84(1H,d,J = 10.5 Hz,H-6aα),4.73(1H,s,H-3a),4.70(1H,s,H-7′),4.22(1H,m,H-5b),4.14(1H,d,J = 11.3 Hz,H-6bα),4.08(1H,m,H-6bβ),4.02(1H,s,H-8′),3.89(1H,d,J = 12.8 Hz,H-6aβ),3.83(1H,s,H-2c),3.83(3H,s,5-OCH3),3.73(1H,m,H-1aα),3.64(1H,m,H-3c),3.60(1H,m,H-4a),3.60(1H,m,H-3b),3.55(1H,m,H-1aβ),3.46(3H,s,3′-OCH3),3.43(1H,m,H-5c),3.39(s,1H),3.30(1H,m,H-2b),3.30(1H,m,H-4c),3.11(1H,t,J = 9.6 Hz,H-4b),1.10(3H,d,J = 6.2 Hz,H-6c);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:172.69(C-9′),166.61(C-9),166.18(C-9″),157.69(C-4″),147.51(C-3′),147.08(C-3′),145.41(C-3),145.14(C-4),143.34(C-7″),140.99(C-7),134.85(C-1′),129.74(C-2″),127.74(C-1″),123.85(C-2),121.50(C-8),119.68(C-6′),116.49(C-3″),115.52(C-8″),115.37(C-5′),111.39(C-2′),109.41(C-6),108.10(C-2a),98.23(C-1c),92.74(C-1b),86.21(C-5a),78.49(C-3a),73.74(C-3b),73.33(C-4a),71.83(C-2b),71.75(C-4c),70.79(C-5b),70.47(C-4b),70.40(C-3c),70.08(C-2c),69.71(C-5c),65.26(C-6a),64.13(C-6b),61.39(C-1a′),59.50(3-OCH3),56.09(5-OCH3),55.35(3′-OCH3),48.52(C-8′),37.62(C-7′),17.92(C-6c)。以上數(shù)據(jù)與El-Rokh等(2018)報(bào)道的一致,故鑒定化合物6為echiumin A。

    化合物7 無(wú)定形黃綠色粉末,[α]+79.1 (c 0.1,MeOH)。ESI-MS m/z:1 007.3 [M+Na]+(C47H52O23Na,理論值:1 007.28),分子式為C47H52O23。1H-NMR(500 MHz,CD3OD-d4)δ:7.74(1H,d,J = 1.1 Hz,H-7),7.34~7.36(3H,m,H-2″,H-6″,H-7″),7.04~7.09(2H,d,H-3″,5″),6.88(1H,s,H-6),6.82(1H,m,H-2′),6.81(1H,m,H-6′),6.55~6.50(2H,m,H-3′,5′),5.85(1H,d,J = 16.0 Hz,H-8″),5.51(1H,d,J = 1.8 Hz,H-1c),5.43(1H,d,J = 3.6 Hz,H-1b),4.95(1H,dd,J = 12.8,2.7 Hz,H-6aα),4.88(1H,s,H-3a),4.81(1H,br s,H-7′),4.46(1H,m,H-5b),4.35(1H,m,H-6b),4.18~4.21(1H,m,H-8′),4.15~4.18(2H,m,H-6b,5a),4.02~4.06(2H,m,H-2c,6aβ),3.97~4.01(1H,m,H-1aα),3.90(3H,s,5-OCH3),3.89(1H,br s,H-3b),3.86~3.88(1H,m,H-3c),3.83(1H,m,H-4a),3.73(1H,d,J = 12.5 Hz,H-1aβ),3.64(1H,m,H-5c),3.55(1H,dd,J = 9.5,3.6 Hz,H-2b),3.50(1H,t,J = 9.5 Hz,H-4c),3.43(3H,s,3-OCH3),3.27~3.31(1H,m,H-4b),1.25(3H,d,J = 6.2 Hz,H-6c);13C-NMR(125 MHz,CD3OD-d4)δ:175.27(C-9′),168.88(C-9),168.52(C-9″),159.42(C-4″),157.03(C-4′),149.05(C-5),146.79(C-3),145.45(C-7″),144.44(C-7),142.75(C-7′),136.66(C-1′),130.87(C-2″),130.87(C-6″),129.71(C-1″),129.57(C-6′),129.57(C-2′),129.57(C-6′),125.35(C-2),123.22(C-1),122.85(C-8),117.60(C-5″),117.60(C-3″),116.53(C-8″),116.35(C-5′),116.35(C-3′),110.06(C-2a),109.70(C-6),99.65(C-1c),94.47(C-1b),88.15(C-5a),80.34(C-3a),75.16(C-3b),75.08(C-4a),73.74(C-2b),73.39(C-4c),72.59(C-4b),72.22(C-5b),72.17(C-3c),71.91(C-2c),70.83(C-5c),66.32(C-6a),66.16(C-6b),63.24(C-1a),60.55(3-OCH3),56.87(5-OCH3),50.72(C-8′),18.07(C-6c)。以上數(shù)據(jù)與El-Rokh等(2018)報(bào)道的一致,故鑒定化合物7為echiumin B。

    化合物8 淡黃色無(wú)定形粉末,[α]+20.6 (c 0.2,MeOH)。ESI-MS m/z:521.2 [M-H]-(C26H33O11,理論值:521.20),分子式為C26H34O111H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:6.68(1H,d,J = 8.0 Hz,H-5′),6.64(1H,d,J = 2.0 Hz,H-2′),6.61(1H,s,H-8),6.51(1H,dd,J = 8.0,2.0 Hz,H-6′),6.10(1H,s,H-5),3.95(1H,d,J = 7.8 Hz,H-1″),3.70(6H,d,J = 2.8 Hz,3′-OCH3,7-OCH3),3.56~3.62(2H,m,H-2a),3.52~3.56(2H,m,H-3a),3.43~3.49(2H,m,H-6″),3.04~3.12(2H,m,H-3″,4″),2.90~2.95(2H,m,H-2″,5″),2.60~2.78(2H,m,H-1),1.83(2H,s,H-2,3);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:147.32(C-3′),145.60(C-7),144.70(C-4′),144.15(C-6),136.99(C-1′),132.17(C-10),127.31(C-9),121.60(C-6′),116.31(C-5),115.30(C-5′),113.23(C-8),111.78(C-2′),102.82(C-1″),76.83(C-3″),76.79(C-5″),73.51(C-2″),69.84(C-2α),68.70(C-4″),63.31(C-6″),60.81(C-3α),55.73(3′-OCH3),55.53(3-OCH3),46.21(C-3),43.59(C-4),32.23(C-1)。以上數(shù)據(jù)與張姣等(2019)報(bào)道的一致,故鑒定化合物8為(+)-異落葉松脂素-2a-O-β-D-葡萄糖苷。

    化合物9 米黃色羽狀晶體,ESI-MS m/z:309.1 [M-H]-(C15H17O7,理論值:309.10),分子式為C15H18O71H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.63(2H,d,J = 8.8 Hz,H-2,6),7.52(1H,d,J = 16.0 Hz,H-7),7.06(2H,d,J = 8.8 Hz,H-3,5),6.39(1H,d,J = 16.0 Hz,H-8),5.44(1H,d,J = 1.8 Hz,H-1′),3.83(1H,dd,J = 3.4,1.8 Hz,H-2′),3.64(1H,dd,J = 9.3,3.3 Hz,H-3′),3.43(1H,m,H-4′),3.29(1H,m,H-5′),1.10(3H,d,J = 6.1 Hz,H-6′);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:167.96(C-9),157.60(C-4),143.21(C-7),129.83(C-2,6),128.07(C-8),117.65(C-1),116.63(C-3,5),98.22(C-1′),71.74(C-4′),70.40(C-3′),70.10(C-2′),69.69(C-5′),17.93(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與劉小輝和華燕(2009)報(bào)道的一致,故鑒定化合物9為對(duì)香豆酰-α-L-鼠李吡喃糖苷。

    化合物10 白色粉末,ESI-MS m/z:163.0 [M-H]-(C9H7O3,理論值:163.04),分子式為C9H8O3。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.47(2H,d,J = 8.3 Hz,H-6,8),7.43(1H,d,J = 15.9 Hz,H-2),6.78(2H,d,J = 8.2 Hz,H-5,9),6.27(1H,d,J = 15.9 Hz,H-3);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:159.39(C-1),142.95(C-3),129.83(C-5,9),125.57(C-4),115.74(C-6,8)。以上數(shù)據(jù)與李春梅等(2012)報(bào)道的一致,故鑒定化合物10為對(duì)香豆酸。

    化合物11 白色針晶,[α]-2.4 (c 0.1,MeOH)。ESI-MS m/z:575.2 [M+Na]+(C27H36O12Na,理論值:575.21),分子式為C27H36O12。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:6.61(1H,s,H-8),6.35(2H,s,H-2′,6′),6.13(1H,s,H-5),3.97(1H,d,J = 7.8 Hz,H-1″),3.71(3H,s,7-OCH3),3.69(6H,s,3′,5′-OCH3),3.36~3.60(6H,H-4,H-2″,H-3″,H-4″,H-5″,H-6″),3.07(m,2H,H-2a),2.93(m,2H,H-3a),2.66~2.75(m,2H,H-1),1.84(2H,m,H-2,H-3);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:147.80(C-3′,C-5′),145.60(C-7),144.10(C-6),135.95(C-1′),133.84(C-4′),131.97(C-10),127.20(C-9),116.15(C-5),111.74(C-8),106.66(C-2′,C-6′),102.81(C-1″),76.86(C-3″),76.75(C-5″),73.50(C-2″),69.82(C-4″),68.73(C-3a),63.27(C-2a),60.79(C-6″),56.08(3′-OCH3),55.46(7-OCH3),46.78(C-4),43.33(C-3),38.90(C-2),32.20(C-1)。以上NMR數(shù)據(jù)與郜嵩等(2005)報(bào)道的一致,故鑒定化合物11為(-)-5′-甲氧基異落葉松脂醇-3α-O-β-D-葡萄糖苷。

    化合物12 黃色粉末,[α]+96.3 (c 0.5,MeOH)。ESI-MS m/z:713.2 [M+Na]+(C32H38O16Na,理論值:713.21),分子式為C32H38O16。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:7.70(1H,s,H-7),7.06(1H,s,H-6),6.77(2H,d,J = 8.3 Hz,H-2′,6′),6.59(2H,d,J = 8.4 Hz,H-3′,5′),5.22(1H,s,H-1),4.82(1H,m,H-6″α),4.71(1H,s,H-3″),4.65(1H,s,H-7′),4.07(1H,d,J = 2.7 Hz,H-5″),3.88(1H,m,H-6″β),3.86(1H,m,H-5),3.84(3H,s,5-OCH3),3.76(1H,s,H-8′),3.69(1H,m,H-1″α),3.59(1H,m,H-4″),3.57(1H,m,H-3),3.56(1H,m,H-1″β),3.50(1H,br s,H-5),3.39(3H,s,3-OCH3),3.28(1H,m,H-2),3.26(1H,m,H-4);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:172.44(C-9′),166.44(C-9),155.82(C-4′),147.49(C-5),145.44(C-3),140.74(C-7),134.25(C-1′),128.30(C-2′),123.38(C-2),115.15(C-3′),109.45(C-6),108.17(C-2″),92.92(C-1),86.27(C-5″),78.65(C-3″),73.68(C-4″),73.63(C-3),73.05(C-5),71.97(C-2),69.22(C-4),65.30(C-6″),61.31(C-1″),59.87(C-6),59.54(3-OCH3),56.05(5-OCH3),49.01(C-8′),37.05(C-7′)。以上 NMR 數(shù)據(jù)與Suo等(2006)報(bào)道的一致,故鑒定化合物12為rupestrin B。

    2.2 抗結(jié)直腸癌活性檢測(cè)結(jié)果

    抗結(jié)直腸癌活性檢測(cè)結(jié)果顯示(表1),化合物8對(duì)SW620細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用,IC50為9.34 μmol·L-1,對(duì)人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用;化合物12對(duì)SW620和HT-29細(xì)胞增殖均具有一定的抑制作用,IC50分別為0.33 μmol·L-1和15.94 μmol·L-1,對(duì)NCM460細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用;化合物6 和化合物7對(duì)NCM460細(xì)胞均無(wú)明顯抑制作用。與陽(yáng)性對(duì)照組比較,化合物12對(duì)SW620細(xì)胞增殖的影響明顯低于陽(yáng)性對(duì)照藥物奧沙利鉑,說(shuō)明化合物12具有較強(qiáng)的抗結(jié)直腸癌活性。以上數(shù)據(jù)表明,化合物8和化合物12具有一定的抗結(jié)直腸癌活性且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性。

    3 討論與結(jié)論

    目前,暫無(wú)鬼點(diǎn)燈的化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理作用相關(guān)的研究報(bào)道,研究通過(guò)現(xiàn)代分離純化技術(shù)從鬼點(diǎn)燈乙酸乙酯部分離鑒定出12個(gè)化合物,其中,木脂素類5個(gè)、苯丙素類3個(gè)、酚酸類2個(gè)、其他類2個(gè),均為首次從該植物中獲得。采用CCK8法檢測(cè)化合物6-8及化合物12對(duì)SW620、HT-29及NCM460細(xì)胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)化合物8和化合物12對(duì)SW620、HT-29細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用且對(duì)人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞(NCM460)增殖無(wú)抑制作用,說(shuō)明化合物8和化合物12在細(xì)胞層面具有一定的抗結(jié)直腸癌活性且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性作用,提示具有一定開(kāi)發(fā)潛力。

    天然產(chǎn)物在治療疾病過(guò)程中具有一定的優(yōu)勢(shì),是抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)的重要來(lái)源。目前,大約有60%的抗腫瘤藥物來(lái)源于天然產(chǎn)物(Seca amp; Pinto,2018)。本研究首先發(fā)現(xiàn)化合物8[(+)-異落葉松脂素-2a-O-β-D-葡萄糖苷]和化合物12(rupestrin B)在體外均具有一定的抗結(jié)直腸癌活性,是天然產(chǎn)物抗腫瘤活性研究的一次有效探索。另有研究者通過(guò)細(xì)胞溶血法、自由基清除能力法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)化合物8具有一定的抗補(bǔ)體作用和抗氧化活性(張姣等,2019)。尚未發(fā)現(xiàn)化合物12其他藥理活性相關(guān)的研究報(bào)道,本研究為首次發(fā)現(xiàn)其具有抗結(jié)直腸癌活性且對(duì)SW620細(xì)胞增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于奧沙利鉑,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt; 0.01),因此存在較大開(kāi)發(fā)潛力,有待開(kāi)發(fā)利用。化合物1(富馬酸)可用于治療慢性心力衰竭(李洋,2023)、銀屑?。℉aghikia et al.,2014)等,因?yàn)槠渚哂锌寡?、抗氧化及有助于重塑肝功能作用而設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過(guò)富馬酸處理后的大鼠可以使肝臟免受鎘毒性(Kaur et al.,2020)?;衔?(原兒茶酸)可通過(guò)改變先天免疫細(xì)胞運(yùn)輸、調(diào)節(jié)代謝和炎癥途徑等對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)揮化學(xué)預(yù)防作用(Dong et al.,2022),并可通過(guò)下調(diào) MYOSLID 表達(dá)而抑制結(jié)腸癌 SW620 細(xì)胞的增殖和糖酵解反應(yīng)(劉經(jīng)州等,2021),可以延緩小鼠排卵后卵母細(xì)胞老化(Li et al.,2023),還具有抗炎、抗腫瘤、改善肝臟炎癥、防止肺損傷等作用(林衛(wèi)佳等,2022)?;衔?(富馬酸單甲酯)具有抑菌作用,可用于治療多發(fā)性硬化,可通過(guò)誘導(dǎo)耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞預(yù)防小鼠心臟移植同種免疫排斥反應(yīng)(Berger et al.,2021; Chen et al.,2023);化合物5(對(duì)羥基苯甲酸)通過(guò)腸道微生物群依賴的方式改善黏膜屏障來(lái)緩解結(jié)腸炎(Han et al.,2022);化合物6(echiumin A)能明顯抑制 NO 產(chǎn)生的活性,即具有一定的抗炎活性(孫冰,2022);化合物10(對(duì)香豆酸)可以減輕大鼠二型糖尿病誘導(dǎo)的神經(jīng)性病變,具有抗菌、抗炎、抗病毒及抗癌等生物活性(Pei et al.,2016; Abdel-Moneim et al.,2017; 張寶等,2023);化合物11[(-)-5′-甲氧基異落葉松脂醇-3α-O-β-D-葡萄糖苷]對(duì)酵母菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用,對(duì)DPPH自由基具有一定清除能力,即具有抗菌和抗氧化活性(Huang et al.,2012;何瑞杰,2021)。以上文獻(xiàn)研究說(shuō)明,從中藥鬼點(diǎn)燈中分離獲得的化合物具有一定的生物活性,研究具有一定意義。

    本研究豐富了鬼點(diǎn)燈的化學(xué)成分,明確了其抗結(jié)直腸癌活性成分,并首先發(fā)現(xiàn)化合物8[(+)-異落葉松脂素-2a-O-β-D-葡萄糖苷]和化合物12(rupestrin B)具有一定的抗結(jié)直腸癌活性,為鬼點(diǎn)燈在抗結(jié)直腸癌方面的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

    參考文獻(xiàn):

    ABDEL-MONEIM A,YOUSEF AI,ABD EL-TWAB SM,et al.,2017. Gallic acid and p-coumaric acid attenuate type 2 diabetes-induced neurodegeneration in rats [J]. Metabolic Brain Disease,32(4):1279-1286.

    BERGER AA,SOTTOSANTI ER,WINNICK A,et al.,2021. Monomethyl fumarate (MMF,Bafiertam) for the treatment of relapsing forms of multiple sclerosis (MS) [J]. Neurology International,13(2):207-223.

    JANG CH,EUN JS,LIM JP,et al.,2003. Phytochemical components from the whole plants of Bothriospermum tenellum [J]. Korean Journal of Pharmacognasy,34(2):119-122.

    CHEN J,CAO Y,JIA O,et al.,2023. Monomethyl fumarate prevents alloimmune rejection in mouse heart transplantation by inducing tolerogenic dendritic cells [J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica,55(5):866-877.

    DONG A,LIN CW,ECHEVESTE CE,et al.,2022. Protocatechuic acid,a gut bacterial metabolite of black raspberries,inhibits adenoma development and alters gut microbiome profiles in ApcMin/+ mice [J]. Journal of Cancer Prevention,27(1):50-57.

    Editorial Committee of the State Administration of Traditional Chinese Medicine,1999. Chinese materia medica:Vol. 6 [M]. Shanghai:Shanghai Scientific amp; Technical Publishers:532. [國(guó)家中醫(yī)藥管理局編委會(huì),1999. 中華本草:第6冊(cè) [M]. 上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社:532.]

    EL-ROKH AR,NEGM A,EL-SHAMY M,et al.,2018. Sucrose diester of aryldihydronaphthalene-type lignans from Echium angustifolium Mill. and their antitumor activity [J]. Phytochemistry,149:155-160.

    GAO S,F(xiàn)U GM,F(xiàn)AN LH,et al.,2005. Studies on the chemical constituents from roots of Lysidice rhodostegia Hance [J]. Chinese Journal of Natural Medicines,3(3):144-147. [郜嵩,浮光苗,范麗華,等,2005. 單刀根化學(xué)成分的研究 [J]. 中國(guó)天然藥物,3(3):144-147.]

    HAN X,LI M,SUN L,et al.,2022. p-Hydroxybenzoic acid ameliorates colitis by improving the mucosal barrier in a gut microbiota-dependent manner [J]. Nutrients,14(24):5383.

    HAGHIKIA A,LINKER R,GOLD R,2014. Fumarsure in der therapie der multiplen sklerose [Fumaric acid as therapeutic agent for multiple sclerosis] [J]. Nervenarzt,85(6):720-726.

    HE RJ,2021. Constituents of the bark of Srteblus indicus and their bioactivities [D]. Guilin:Guangxi Normal University:94-98. [何瑞杰,2021. 假鵲腎樹(shù)樹(shù)皮化學(xué)成分及其生物活性的研究 [D]. 桂林:廣西師范大學(xué):94-98.]

    HUANG XZ,CHENG CM,DAI Y,et al.,2012. A novel lignan glycoside with antioxidant activity from Tinospora sagittata var. yunnanensis [J]. Natural Product Research,26(20):1876-1880.

    KAUR G,SHIVANANDAPPA TB,KUMAR M,et al.,2020. Fumaric acid protect the cadmium-induced hepatotoxicity in rats:Owing to its antioxidant,anti-inflammatoryaction and aid in recast the liver function [J]. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology,393(10):1911-1920.

    LI CM,WU CH,WANG T,et al.,2012. Isolation and identification of chemical constituents from whole plants of Siphonostegia chinensis Benth. [J]. Journal of Shenyang Pharmaceutical University,29(5):331-336. [李春梅,吳春華,王濤,等,2012. 中藥北劉寄奴中化學(xué)成分的分離與鑒定 [J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),29(5):331-336.]

    LI GQ,DENG ZW,LI J,et al.,2004. Chemical constituents from starfish Asterias rollestoni [J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,13(2):81-86.

    LI LJ,CHAO S,ZHAO SX,et al.,2023. Protocatechuic acid delays postovulatory oocyte ageing in mouse [J]. Molecular Nutrition amp; Food Research,67(4):e2200363.

    LIN WJ,ZHANG YP,LI F,et al.,2022. Protocatechuic acid inhibits apoptosis of alveolar macrophages induced by Mycobacterium tuberculosis Rv1654 [J]. Chinese Journal of Clinical Pharmacology,38(15):1747-1751. [林衛(wèi)佳,張亞平,李峰,等,2022. 原兒茶酸抑制結(jié)核分枝桿菌Rv1654誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究 [J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,38(15):1747-1751.]

    LI Y,2023. Selection of fumaric acid-producing rhizopus species and transcript level analysis of key enzymes [D]. Beijing:Beijing University of Chemical Technology:1-70. [李洋,2023. 產(chǎn)富馬酸的根霉菌種選育及關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄水平分析 [D]. 北京:北京化工大學(xué):1-70.]

    LIU XH,HUA Y,2009. Study on the phenylpropanoids composition from Desmodium microphyllum [J]. Journal of Southwest Forestry University (Natural Sciences),29(2):92-93. [劉小輝,華燕,2009. 小葉三點(diǎn)金的苯丙素類成分分析 [J]. 西南林學(xué)院學(xué)報(bào),29(2):92-93. ]

    LIU JZ,YANG HQ,MA DW,2021. Effects of protocatechuic acid on glycolysis and proliferation of colon cancer SW620 cells [J]. Chinese Traditional Patent Medicine,43(7):1914-1918. [劉經(jīng)州,楊紅群,馬東旺,2021. 原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞糖酵解及增殖的影響 [J]. 中成藥,43(7):1914-1918.]

    PEI K,OU J,HUANG J,et al.,2016. p-Coumaric acid and its conjugates:dietary sources,pharmacokinetic properties and biological activities [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,96(9):2952-2962.

    RAMADAN MA,AHMAD AS,NAFADY AM,et al.,2009. Chemical composition of the stem bark and leaves of Ficus pandurata Hance [J]. Natural Product Research,23(13):1218-1230.

    SECA AML,PINTO DCGA,2018. Plant secondary metabolites as anticancer agents:Successes in clinical trials and therapeutic application [J]. International Journal of Molecular Sciences,19(1):263.

    SHENG XJ,YUAN WJ,LIU JY,et al.,2023. Research progress on chemical components and biological activities of Zicao [J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine,41(11):102-110. [沈曉靜,袁文娟,劉佳瑤,等,2023. 紫草化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊,41(11):102-110.]

    SUO MR,YANG JS,LIU QH,2006. Lignan oligosaccharide esters from Eritrichium rupestre [J]. Journal of Natural Products,69(4):682-684.

    SUN B,2022. The chemicals and their potential bioactive investigation from Onosma bracteatum Wall. and Tricholoma matsutake Sing [D]. Nanjing:Nanjing University of Science amp; Technology:60-62. [孫冰,2022. 滇紫草烏飯和松茸的化學(xué)成分及其生物活性的研究 [D]. 南京:南京理工大學(xué):60-62.]

    SU YL,2021. Investigation and evaluation of medicinal plant resource in Lipu City,Guangxi [D]. Guilin:Guangxi Normal University:94. [蘇鈺嵐,2021. 廣西荔浦市藥用植物資源調(diào)查與評(píng)價(jià) [D]. 桂林:廣西師范大學(xué):94.]

    TIAN YJ,LI JN,F(xiàn)ENG JL,et al.,2013. Chemical constituents from Notopterygium root [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,15(6):40-42. [田宇潔,李金楠,馮金磊,等,2013. 羌活化學(xué)成分研究 [J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),15(6):40-42.]

    WANG ZJ,ZHAO YY,WANG B,et al.,2000. Depsides from Prunella vulgaris [J]. Chinese Chemical Letters,11(11):997-1000.

    ZHANG B,LIU J,KUANG WM,et al.,2023. Chemical constituents from Potentilla kleiniana and their anti-inflammatory activities [J]. Guihaia,43(11):2149-2158. [張寶,劉佳,匡維米,等,2023. 蛇含委陵菜的化學(xué)成分及抗炎活性研究 [J]. 廣西植物,43(11):2149-2158.]

    ZHANG J,DE J,F(xiàn)U AL,et al.,2019. Anti-complementary and anti-oxidant activities of constituents from Juniperus convallium [J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs,50(13):3008-3016. [張姣,德吉,付愛(ài)玲,等,2019. 密枝圓柏的化學(xué)成分及其抗補(bǔ)體、抗氧化活性 [J]. 中草藥,50(13):3008-3016.]

    ZHANG M,HE ZY,HUANG QY,et al.,2022. Effect of ferroptosis inducer Erastin on apoptosis of colorectal cancer induced by shikonin [J]. Chinese Pharmacological Bulletin,38(5):692-698. [張梅,何旨意,黃慶洋,等,2022. 鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin促進(jìn)紫草素誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的作用 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),38(5):692-698.]

    ZHAO XC,HU XX,CHENG YG,et al.,2023. Liposoluble constituents and antioxidant activity of Bothriospermum zeylanicum [J]. China Pharmaceuticals,32(4):55-58. [趙小超,胡筱希,程英歌,等,2023 鬼點(diǎn)燈藥材脂溶性成分及抗氧化活性研究 [J]. 中國(guó)藥業(yè),32(4):55-58.]

    ZHENG ZW,ZHANG X,BAI J,et al.,2022. PGM1 suppresses colorectal cancer cell migration and invasion by regulating the PI3K/AKT pathway [J]. Cancer Cell International,22(1):201.

    (責(zé)任編輯 周翠鳴)

    猜你喜歡
    結(jié)構(gòu)鑒定化學(xué)成分
    黃獨(dú)鮮塊根化學(xué)成分研究
    壯藥積雪草主要化學(xué)成分及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)作用的研究進(jìn)展
    山荊子化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展
    金線蓮的研究進(jìn)展
    九龍?zhí)僖宜嵋阴ゲ课换瘜W(xué)成分的分離鑒定
    核桃青皮的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展
    抱莖苦荬菜的化學(xué)成分研究
    建筑結(jié)構(gòu)鑒定與加固改造技術(shù)
    雪靈芝的研究進(jìn)展
    科技視界(2016年9期)2016-04-26 12:19:35
    雙齒圍沙蠶化學(xué)成分及其浸膏抗腫瘤活性的研究
    激情 狠狠 欧美| 国产高清三级在线| 一区二区三区四区激情视频 | 久久久成人免费电影| 欧美色欧美亚洲另类二区| 一级黄色大片毛片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲精品国产av成人精品 | 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 插阴视频在线观看视频| 久久人妻av系列| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲乱码一区二区免费版| 97在线视频观看| 午夜精品在线福利| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产高潮美女av| 国产精品人妻久久久影院| 精品久久久久久久末码| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产午夜精品论理片| 亚洲精品在线观看二区| 中文字幕熟女人妻在线| 韩国av在线不卡| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 永久网站在线| 九色成人免费人妻av| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久久久久九九精品二区国产| 国产男人的电影天堂91| 熟女人妻精品中文字幕| 尾随美女入室| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产成人a∨麻豆精品| 国产v大片淫在线免费观看| 色5月婷婷丁香| 婷婷精品国产亚洲av在线| a级毛片a级免费在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 色综合站精品国产| 欧美3d第一页| 亚洲色图av天堂| eeuss影院久久| 精品免费久久久久久久清纯| 女人被狂操c到高潮| 91狼人影院| 2021天堂中文幕一二区在线观| or卡值多少钱| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 精品久久久久久久久亚洲| 麻豆国产97在线/欧美| 午夜精品在线福利| 看黄色毛片网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 99热全是精品| 国产午夜精品论理片| 日本五十路高清| 中文字幕熟女人妻在线| 国产69精品久久久久777片| 色5月婷婷丁香| 国产精品无大码| or卡值多少钱| 啦啦啦啦在线视频资源| 网址你懂的国产日韩在线| 国产一区二区三区av在线 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲美女视频黄频| 天堂√8在线中文| 精品一区二区免费观看| 亚洲国产欧美人成| 我要看日韩黄色一级片| 日本一二三区视频观看| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲美女搞黄在线观看 | 一级a爱片免费观看的视频| 午夜福利视频1000在线观看| 最近在线观看免费完整版| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲av成人精品一区久久| 色综合站精品国产| 色综合站精品国产| 美女内射精品一级片tv| 最近手机中文字幕大全| 午夜福利视频1000在线观看| 如何舔出高潮| 免费观看精品视频网站| 一个人看的www免费观看视频| av.在线天堂| 深夜a级毛片| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品三级大全| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 国内精品一区二区在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 高清日韩中文字幕在线| 99在线视频只有这里精品首页| 美女被艹到高潮喷水动态| 全区人妻精品视频| 男女边吃奶边做爰视频| 老司机福利观看| 亚洲av二区三区四区| 香蕉av资源在线| 亚洲欧美清纯卡通| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 午夜福利高清视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 九九爱精品视频在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久久国产成人免费| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 一级毛片电影观看 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| av在线蜜桃| av.在线天堂| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 久久久色成人| 亚洲在线观看片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产三级在线视频| 国产精品福利在线免费观看| 在线观看av片永久免费下载| 香蕉av资源在线| 天美传媒精品一区二区| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲人成网站高清观看| 免费无遮挡裸体视频| 午夜福利18| 亚洲精品色激情综合| 久久久色成人| 黄色欧美视频在线观看| 91久久精品电影网| 波多野结衣高清作品| 精品欧美国产一区二区三| 国产色爽女视频免费观看| 看免费成人av毛片| 欧美一区二区精品小视频在线| 日本黄色视频三级网站网址| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 男人和女人高潮做爰伦理| 三级毛片av免费| 国产精品伦人一区二区| 男女那种视频在线观看| av在线亚洲专区| 国产高清视频在线播放一区| avwww免费| 欧美日韩乱码在线| 国产欧美日韩一区二区精品| av黄色大香蕉| 波多野结衣巨乳人妻| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 一级毛片电影观看 | 精品福利观看| 大型黄色视频在线免费观看| 久久久久久久久大av| 色播亚洲综合网| 老司机午夜福利在线观看视频| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| a级毛片免费高清观看在线播放| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 色尼玛亚洲综合影院| 国产色婷婷99| 伦理电影大哥的女人| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日韩欧美三级三区| 久久6这里有精品| a级毛色黄片| 麻豆一二三区av精品| 精品福利观看| 婷婷六月久久综合丁香| 免费观看的影片在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 九九在线视频观看精品| 国产免费一级a男人的天堂| 国产午夜精品论理片| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 精品福利观看| 婷婷六月久久综合丁香| 午夜影院日韩av| 国产精品av视频在线免费观看| 超碰av人人做人人爽久久| 一区二区三区免费毛片| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品不卡视频一区二区| 1000部很黄的大片| 久久中文看片网| 毛片女人毛片| 国产在线精品亚洲第一网站| 97碰自拍视频| 免费观看人在逋| 内地一区二区视频在线| 不卡视频在线观看欧美| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 99久久九九国产精品国产免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚州av有码| 免费搜索国产男女视频| 午夜福利成人在线免费观看| 国产免费男女视频| 国产三级在线视频| 中文字幕熟女人妻在线| 国产亚洲欧美98| 国产成人一区二区在线| av在线观看视频网站免费| 91久久精品国产一区二区三区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 青春草视频在线免费观看| 国产免费一级a男人的天堂| 成人特级av手机在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久精品人妻少妇| 亚洲一区二区三区色噜噜| 香蕉av资源在线| 午夜爱爱视频在线播放| 啦啦啦韩国在线观看视频| 久久精品91蜜桃| 日本 av在线| 成人午夜高清在线视频| 91精品国产九色| 国内精品一区二区在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 夜夜爽天天搞| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩国内少妇激情av| 91av网一区二区| 69av精品久久久久久| 国产日本99.免费观看| 国产av麻豆久久久久久久| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产av不卡久久| 一边摸一边抽搐一进一小说| 中文字幕免费在线视频6| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产爱豆传媒在线观看| 精品久久久久久久久av| 久久午夜亚洲精品久久| 成人一区二区视频在线观看| 成年女人看的毛片在线观看| 国产成人91sexporn| av卡一久久| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产成人91sexporn| 99久国产av精品国产电影| 免费人成在线观看视频色| 色在线成人网| 免费在线观看成人毛片| 一进一出抽搐gif免费好疼| 美女内射精品一级片tv| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| a级毛片a级免费在线| 十八禁国产超污无遮挡网站| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久99热6这里只有精品| 国产一级毛片七仙女欲春2| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产成人freesex在线 | 国产老妇女一区| 偷拍熟女少妇极品色| 青春草视频在线免费观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 极品教师在线视频| 日本与韩国留学比较| 1024手机看黄色片| 日本黄色视频三级网站网址| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美不卡视频在线免费观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 日本成人三级电影网站| 我的女老师完整版在线观看| 精品久久久久久久末码| 久久久a久久爽久久v久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 91麻豆精品激情在线观看国产| 一级毛片我不卡| 免费人成在线观看视频色| 久久人人精品亚洲av| 免费搜索国产男女视频| 亚洲在线观看片| 日韩欧美精品v在线| 日韩欧美精品免费久久| 日韩一区二区视频免费看| 91av网一区二区| 99riav亚洲国产免费| 免费av观看视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 日韩在线高清观看一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲七黄色美女视频| 级片在线观看| 久久精品91蜜桃| 露出奶头的视频| 亚洲av不卡在线观看| 在线a可以看的网站| 亚洲自偷自拍三级| 成人av在线播放网站| 赤兔流量卡办理| 国产精品福利在线免费观看| 男女视频在线观看网站免费| 不卡视频在线观看欧美| 嫩草影院新地址| 97超碰精品成人国产| 国产av不卡久久| 色尼玛亚洲综合影院| 嫩草影视91久久| 午夜福利高清视频| 欧美精品国产亚洲| 免费在线观看成人毛片| 久久久精品94久久精品| 51国产日韩欧美| 国产免费男女视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 1024手机看黄色片| 国产成人一区二区在线| АⅤ资源中文在线天堂| 校园春色视频在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 嫩草影院精品99| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲av成人精品一区久久| 国产一级毛片七仙女欲春2| 俄罗斯特黄特色一大片| 精品人妻一区二区三区麻豆 | av在线观看视频网站免费| 天堂√8在线中文| 一a级毛片在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产欧美日韩精品一区二区| 91av网一区二区| 久久中文看片网| 国产69精品久久久久777片| 成人美女网站在线观看视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 白带黄色成豆腐渣| 十八禁网站免费在线| 99热全是精品| 亚洲av二区三区四区| 精品久久国产蜜桃| 特大巨黑吊av在线直播| 色哟哟哟哟哟哟| 精品免费久久久久久久清纯| 国产av麻豆久久久久久久| 91av网一区二区| 最近在线观看免费完整版| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲av美国av| 欧美3d第一页| 日本-黄色视频高清免费观看| 精品久久久久久久久av| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产精品一区二区三区四区久久| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 伦理电影大哥的女人| 十八禁网站免费在线| 欧美3d第一页| 免费在线观看影片大全网站| 天美传媒精品一区二区| 性欧美人与动物交配| 日本-黄色视频高清免费观看| 深爱激情五月婷婷| 在线播放国产精品三级| 97碰自拍视频| 日韩欧美精品免费久久| 日韩精品中文字幕看吧| 国产男人的电影天堂91| 成人美女网站在线观看视频| 麻豆国产97在线/欧美| 99久久精品一区二区三区| 色综合站精品国产| 国产精品亚洲美女久久久| av在线天堂中文字幕| 成人永久免费在线观看视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 成年版毛片免费区| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲中文字幕日韩| 成人av在线播放网站| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 99热6这里只有精品| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美日韩在线观看h| 欧美中文日本在线观看视频| 精品国产三级普通话版| 级片在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日本a在线网址| 成年版毛片免费区| 美女cb高潮喷水在线观看| 身体一侧抽搐| 国产麻豆成人av免费视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久精品国产亚洲网站| 五月伊人婷婷丁香| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日韩三级伦理在线观看| 欧美潮喷喷水| 嫩草影院精品99| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 嫩草影院入口| 色哟哟哟哟哟哟| 日韩 亚洲 欧美在线| 97碰自拍视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 99热网站在线观看| 国产单亲对白刺激| 在线观看av片永久免费下载| 国产精华一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| 99久久精品一区二区三区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲精品影视一区二区三区av| 中国美白少妇内射xxxbb| 色哟哟·www| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久精品夜色国产| 1000部很黄的大片| 男插女下体视频免费在线播放| 色综合色国产| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产精品三级大全| 干丝袜人妻中文字幕| 两个人的视频大全免费| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产 一区 欧美 日韩| 成人毛片a级毛片在线播放| 免费观看的影片在线观看| av天堂中文字幕网| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 中文字幕av在线有码专区| 欧美精品国产亚洲| 久久久a久久爽久久v久久| 国产伦精品一区二区三区视频9| 成年女人毛片免费观看观看9| av天堂在线播放| 久久久色成人| 永久网站在线| 男插女下体视频免费在线播放| 免费av不卡在线播放| 天美传媒精品一区二区| 91狼人影院| 国国产精品蜜臀av免费| 国产色婷婷99| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 色哟哟·www| 日韩高清综合在线| 亚洲色图av天堂| 两个人视频免费观看高清| 国产伦精品一区二区三区四那| 午夜a级毛片| 如何舔出高潮| 国产不卡一卡二| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日韩精品中文字幕看吧| 国产黄色小视频在线观看| 日韩欧美在线乱码| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲av五月六月丁香网| 69av精品久久久久久| 大香蕉久久网| 色播亚洲综合网| 亚洲,欧美,日韩| 九九热线精品视视频播放| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 又爽又黄a免费视频| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 99久久精品一区二区三区| 国产精品人妻久久久影院| 免费黄网站久久成人精品| 一区福利在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品人妻熟女av久视频| 1000部很黄的大片| 男人的好看免费观看在线视频| 一级黄色大片毛片| 国模一区二区三区四区视频| av天堂中文字幕网| 插阴视频在线观看视频| 国产极品精品免费视频能看的| 亚洲精品国产av成人精品 | 亚洲最大成人手机在线| 全区人妻精品视频| 久久九九热精品免费| 日本黄大片高清| 老司机影院成人| 12—13女人毛片做爰片一| 成人性生交大片免费视频hd| 老熟妇仑乱视频hdxx| 午夜精品在线福利| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 精品无人区乱码1区二区| 日韩欧美精品v在线| 内地一区二区视频在线| 日韩欧美三级三区| 国产探花在线观看一区二区| 长腿黑丝高跟| a级一级毛片免费在线观看| 丰满乱子伦码专区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 91久久精品国产一区二区三区| a级一级毛片免费在线观看| 床上黄色一级片| 成人综合一区亚洲| 久久精品综合一区二区三区| 真人做人爱边吃奶动态| 91久久精品国产一区二区三区| 日韩欧美在线乱码| 天堂动漫精品| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 少妇的逼水好多| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲在线自拍视频| 十八禁网站免费在线| 麻豆一二三区av精品| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品99久久久久久久久| 日本爱情动作片www.在线观看 | 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 在线播放国产精品三级| 亚洲性夜色夜夜综合| 三级经典国产精品| 一级黄片播放器| 香蕉av资源在线| 91狼人影院| 日本欧美国产在线视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 成人综合一区亚洲| 日韩av在线大香蕉| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲第一电影网av| 国产精品女同一区二区软件| 日本-黄色视频高清免费观看| 免费看日本二区| 国产高清视频在线观看网站| 国产探花极品一区二区| 在线免费十八禁| 最新中文字幕久久久久| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品久久视频播放| av在线观看视频网站免费| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 一夜夜www| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 成人特级av手机在线观看| 九九在线视频观看精品| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 色综合色国产| 国产中年淑女户外野战色| 国产精品,欧美在线| 国产免费男女视频| 能在线免费观看的黄片| 免费av毛片视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 男人和女人高潮做爰伦理| 一区福利在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 男人和女人高潮做爰伦理| 午夜a级毛片| 久久亚洲国产成人精品v| 在现免费观看毛片| 午夜a级毛片| 尾随美女入室| 国产片特级美女逼逼视频| 午夜a级毛片| 尾随美女入室| 亚洲国产色片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久亚洲精品不卡| 国产午夜精品论理片| 在线免费十八禁| 亚洲综合色惰| 久久久久久久久久成人| videossex国产| 在线观看66精品国产| 久久久国产成人精品二区| 亚洲内射少妇av| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产精品一区二区性色av| 日本在线视频免费播放| 久久综合国产亚洲精品| 久久久久久九九精品二区国产| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 午夜亚洲福利在线播放| 大型黄色视频在线免费观看|