陸地棉種質資源抗黃萎病性狀的SSR標記關聯(lián)分析

摘 要 對棉花抗黃萎病性狀進行全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS），發(fā)掘與其關聯(lián)的標記位點、優(yōu)異等位變異及典型材料，可為棉花抗黃萎病的分子育種提供理論依據(jù)。以403份陸地棉品種（系）資源為材料，利用覆蓋全基因組的、有多態(tài)性的201對SSR標記，對3個環(huán)境的抗黃萎病性狀進行基于混合線性模型（mixed linear model，MLM）的全基因組關聯(lián)分析，檢測與抗病性狀顯著關聯(lián)的位點、優(yōu)異等位變異及優(yōu)異典型材料。結果表明，3個環(huán)境下各材料的相對病指平均值為53.45，平均變異系數(shù)為" 36.85%，平均偏度系數(shù)為-0.46，平均峰度系數(shù)為-0.31；201對引物共產(chǎn)生394個等位變異位點，GWAS結果表明有11個位點能同時在2個環(huán)境中檢測到，其中有2個位點NAU2437b和NAU3493b能同時在3個環(huán)境中檢測到；結合育種實際，發(fā)掘出含有優(yōu)異等位變異的典型材料7份，其中魯棉研28同時含有9個優(yōu)異等位變異；從各材料不同生態(tài)區(qū)來源分析，來源于黃河流域棉區(qū)的材料具有較低的平均表型效應。

關鍵詞 陸地棉；黃萎??；關聯(lián)分析；優(yōu)異等位基因

棉花黃萎病是棉花生產(chǎn)上主要的病害，被稱為棉花的“癌癥”^[1]。目前，棉花黃萎病是中國棉花生產(chǎn)上危害最為嚴重的病害。尤其近年來在西北內陸棉區(qū)由于常年連作，導致棉花黃萎病害有逐漸加重的趨勢，嚴重影響了棉花生產(chǎn)的發(fā)展^[2]。防治黃萎病最經(jīng)濟有效、環(huán)保安全的方法就是培育具有抗黃萎病性的優(yōu)良品種^[3]。研究發(fā)現(xiàn)，黃萎病抗性屬于數(shù)量性狀遺傳^[4]，其遺傳特征還未明確，其中海島棉對黃萎病的抗性受單基因或少數(shù)主效基因控制^[5]。在棉花抗病育種中，開展抗黃萎病性狀的QTL定位研究，挖掘出穩(wěn)定表達的QTL和優(yōu)異等位基因，對提高棉花黃萎病抗性具有重要的理論與應用價值。

國內外研究學者通過構建不同的連鎖分離群體，應用各類型分子標記定位了多個與抗黃萎病性狀相關的QTLs^[6-17]，為進一步挖掘抗病基因提供了很好的研究基礎。隨著分子生物學和生物統(tǒng)計學的進一步發(fā)展，基于連鎖不平衡的關聯(lián)分析方法在挖掘基因方面得到廣泛應用，相對于傳統(tǒng)的連鎖分析更易找到微效基因，且群體樣本收集相對容易，一定數(shù)量的自然群體或種質資源群體即可進行分析，不需要建立專門的作圖群體，且定位精確度高于傳統(tǒng)的連鎖分析方法。在棉花抗病基因挖掘方面已有應用^[18-21]，為抗黃萎病性狀的深入研究奠定了基礎，但目前仍缺少主效QTL應用于棉花抗病育種中。本研究以中國不同棉區(qū)的403份陸地棉種質資源為研究材料，2016-2017年分別在新疆農(nóng)墾科學院石河子黃萎病圃和博樂黃萎病圃兩塊發(fā)病均勻的自然黃萎病圃進行抗黃萎病性狀鑒定，并結合均勻覆蓋染色體的SSR標記進行全基因組關聯(lián)分析研究。研究結果可為棉花抗黃萎病分子育種提供理論基礎和標記來源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選取403份陸地棉種質資源為試驗材料，來自新疆農(nóng)墾科學院棉花研究所多年來收集保存的國內外種質資源，其中199份來自于中國西北內陸棉區(qū)（NIR：the Northwestern Inland Region），87份來自于黃河流域棉區(qū)（YRR：the Yellow River Region），63份來自于長江流域棉區(qū)（YtRR：the Yangtze River Region），29份來自于北部特早熟棉區(qū)（NSEMR：the Northern Specific Ear ly Maturation Region），25份來自于國外（Abroad）。試驗材料來源及分類與前期報道的一致^[22]。

1.2 田間試驗

為獲取403份材料的抗黃萎病性狀，試驗于2016年、2017年連續(xù)兩年在新疆農(nóng)墾科學院棉花研究所博樂89團黃萎病圃，2017年在新疆農(nóng)墾科學院棉花研究所石河子143團黃萎病圃種植各材料，兩塊病地均屬自然黃萎病圃且發(fā)病均勻、致病性較強。各環(huán)境分別命名為：BL16、BL17和SHZ17。各試驗點田間試驗采用完全隨機區(qū)組設計，2次重復，雙行區(qū)，平均行距38 cm，平均株距9 cm，各材料人工點播種植，膜下滴灌栽培，以當?shù)爻Ｒ?guī)方法進行田間管理。

1.3 黃萎病性狀調查

2016年-2017年在新疆博樂89團環(huán)境下（BL16、BL17），2017年在新疆石河子143團環(huán)境下（SHZ17），分別在黃萎病發(fā)病高峰期（博樂89團2016年-2017為每年的9月1日，石河子143團2017年為8月26日）調查對照材料‘新陸早9號’的病情指數(shù)，當對照病指達到或接近50時，開始調查全部材料的病指，每個材料調查20株，并依據(jù)國家標準（GBT 22101.5-2009）中所述的五級分類法判斷發(fā)病級別，根據(jù)調查結果，參考朱荷琴等^[23]的方法計算出病情指數(shù)和相對病情指數(shù)，其中：病情指數(shù)= [∑（各級病株數(shù)×相應病" 級） /調查總株數(shù)×最高病級 （4） ]×100；相對病情指數(shù)（ IR） = K×鑒定材料的實際病指，其中" K=50÷對照實際病指（50為規(guī)定感病對照品種的標準病指）。最終以相對病情指數(shù)（IR）來進行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

1.4 SSR標記及基因型鑒定

各試驗材料的基因組DNA提取參照Paterson等^[24]發(fā)表的CTAB方法進行，SSR引物選擇主要結合前人已發(fā)表的棉花四倍體分子遺傳圖譜及在陸地棉中多態(tài)性較好的SSR標記結果，選取均勻分布在26條染色體的560對引物對群體進行PCR擴增分析。具體詳見前期文獻報道^[22]。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。分子標記名稱中的大寫字母，如BNL、JESPR、HAU、NAU等表示引物的來源，引物名稱后的小寫字母“a”“b” “c”“d”等代表標記的多態(tài)性位點，且位點順序依次按分子量由大到小排列。SSR分子標記實驗操作規(guī)程及PCR擴增分析參照張軍等^[25]的研究，擴增后的PCR產(chǎn)物電泳分析采用毛細管電泳分析儀FragmentAnalyzer-XL960 SSR/Tilling系統(tǒng)進行，電泳結果使用系統(tǒng)自帶軟件ProSize軟件查看，根據(jù)膠視圖中DNA Ladder判斷樣品不同位點片段大小，相同位點有條帶記為“1”，無條帶記為“0”^[26]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

黃萎病表型性狀一般性描述統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件進行；多態(tài)性標記等位基因頻率、基因多樣性指數(shù)等采用PowerMarker V3.25軟件進行；在群體結構分析、連鎖不平衡分析的基礎上，利用MLM （mixed linear model）進行性狀和標記之間的關聯(lián)分析，并計算標記位點在 Plt;" 0.05 和 Plt;0.01 時對表型變異的貢獻率（R²）。在已獲得關聯(lián)位點的基礎上，再進行優(yōu)異等位變異的發(fā)掘，具體分析詳見前期文獻報道^[26]。

2 結果與分析

2.1 表型性狀分析

403份材料抗黃萎病性狀的兩年兩點三環(huán)境的抗性結果見圖1和表1。結果顯示：相對病情指數(shù)在BL16、BL17及SHZ17環(huán)境下均值分別為55.41、55.08和49.86，3個環(huán)境下平均值為" 53.45；變異系數(shù)分別為33.37%、28.28%和" 48.90%，3個環(huán)境下平均變異系數(shù)為36.85%，表現(xiàn)出較高的變異系數(shù)；3個環(huán)境的相對病情指數(shù)的平均偏度系數(shù)為-0.46，平均峰度系數(shù)為" -0.3 說明不同病圃的相對病指結果均接近正態(tài)分布規(guī)律；從3個環(huán)境的相對病情指數(shù)和變異系數(shù)結果可以看出（表1），同一病圃的不同年份性狀結果相對穩(wěn)定，而同一年份的不同病圃性狀結果表現(xiàn)一致性差，受環(huán)境影響較大。

2.2 SSR標記的遺傳多樣性

選取的560對SSR 標記中，最終獲得201對標記在群體中產(chǎn)生多態(tài)性，基于201個SSR分子標記的遺傳多樣性指數(shù)結果，對403份材料的遺傳多樣性進行了評估。結果表明，A亞組平均等位基因頻率為0.558 3，平均遺傳多樣性指數(shù)為0.564 "D亞組平均等位基因頻率為" 0.567 7，平均遺傳多樣性指數(shù)為0.548 4，A亞組遺傳多樣性略高于D亞組，AD 全基因組的遺傳多樣性指數(shù)平均值為0.555 7（表2）。以上結果表明，本研究所選取的SSR引物在所選種質材料中檢測到的等位基因頻率和基因多樣性指數(shù)的平均值較高，說明本研究所選取的陸地棉種質資源群體在基因組水平上變異比較豐富，表現(xiàn)出較高的遺傳多" 樣性。

2.3 關聯(lián)分析及優(yōu)異等位變異挖掘

利用201對引物產(chǎn)生的394個等位變異位點，對403份材料進行群體結構分析、主成分分析及聚類分析的基礎上^[22]，利用TASSEL 5.0軟件的混合線性模型MLM（Q+K）程序，將上述394個位點的等位變異分別與不同環(huán)境下的抗黃萎病性狀進行了關聯(lián)分析。為最大程度地避免虛假關聯(lián)的出現(xiàn)，研究結果只考慮能同時在兩個以上環(huán)境中檢測到的顯著（Plt;0.05）關聯(lián)的位點。結果表明，共11個位點能同時在兩個環(huán)境中檢測到，其中有2個位點NAU2437b和NAU3493b能同時在3個環(huán)境中檢測到（表3）；11個關聯(lián)位點的等位變異表型效應值變化范圍為-9.96～" -0.08；結合育種實際，以黃萎病病指最低為優(yōu)異等位變異，發(fā)掘出含有優(yōu)異等位變異的典型材料7份（表3），其中魯棉研28同時含有9個優(yōu)異等位變異，9456D同時含有7個優(yōu)異等位變異，31503和CL12兩份材料同時含有6個優(yōu)異等位變異，銀山4號和晉棉38兩份材料同時含有2個優(yōu)異等位變異，新陸中32號含有1個優(yōu)異等位變異。

2.4 不同生態(tài)區(qū)種質材料抗病優(yōu)異等位變異" 分析

為明確優(yōu)異等位變異的地域分布情況，對403份種質材料按照不同生態(tài)區(qū)來源比較優(yōu)異等位變異出現(xiàn)的頻率。結果表明（表4），在每個關聯(lián)位點含有的優(yōu)異等位變異材料個數(shù)中，其中有4個關聯(lián)位點（HAU3101b、NAU3031c、NAU3308a和NAU2691a）來源于西北內陸棉區(qū)的材料出現(xiàn)頻率最多，有3個關聯(lián)位點（BNL3280、HAU1292a和NAU4057a）來源于長江流域棉區(qū)的材料出現(xiàn)頻率最多，有兩個關聯(lián)位點（BNL3594c和NAU3493b）來源于國外棉區(qū)的材料出現(xiàn)頻率最多，有一個關聯(lián)位點（NAU2437b）來源于黃河流域棉區(qū)的材料出現(xiàn)頻率最多，有一個關聯(lián)位點（NAU5335a）來源于北部特早熟棉區(qū)的材料出現(xiàn)頻率最多；進一步分析各生態(tài)區(qū)材料在每個關聯(lián)位點中含有優(yōu)異等位變異的抗黃萎病病指的平均表型效應發(fā)現(xiàn)（圖2），來源于黃河流域棉區(qū)的材料具有較低的平均表型效應，其次為來源于長江流域棉區(qū)的材料，而來源于國外棉區(qū)的材料具有較高的平均表型效應。

3 討" 論

棉花黃萎病屬于土傳維管束系統(tǒng)性病害，且抗病遺傳機制較為復雜。因此，對鑒定材料的精準表型鑒定尤為重要。對于棉花抗黃萎病性的鑒定方法，當前主要有田間病圃鑒定、營養(yǎng)缽苗期鑒定和黃萎病菌毒素等鑒定方法^[27]。從選育抗黃萎病品種角度而言，田間病圃鑒定法更能直接有效的鑒定出各材料的抗病性，是目前較為常用的方法。本研究利用本研究所不同環(huán)境的田間育種病圃對403份材料進行抗黃萎病性鑒定，并設置不同重復，且在鑒定過程中通過設置合適的感病對照品種，利用相對病情指數(shù)來劃分棉花品種的抗病性，可進一步有效降低環(huán)境變異的影響^[28]，提高鑒定的精準性，為后續(xù)關聯(lián)分析提供較為精準的表型數(shù)據(jù)。

國內外研究學者通過構建不同分離群體和利用自然群體，應用各類型分子標記發(fā)掘定位了多個與抗黃萎病性狀相關的QTLs和關聯(lián)位點。甄瑞等^[10]以高抗黃萎病的海島棉品種和高感黃萎病的陸地棉品種構建了一個海陸雜交F2群體，利用SSR分子標記，采用極端混合分析法發(fā)現(xiàn)一個與抗黃萎病性緊密連鎖的標記；王省芬等^[11]對甄瑞等定位到標記在不同群體中進行進一步驗證，并進行測序發(fā)現(xiàn)該片段為含有TG重復且長211bp的片段，可用于抗黃萎病性狀的分子輔助育種研究；Li等^[20]對299個棉花材料進行簡化基因組測序結合關聯(lián)分析，鑒定出17個SNP與黃萎病抗性有關，其中A10上的1個SNP表現(xiàn)為多環(huán)境穩(wěn)定，并鑒定到1個基因CG02可能是與抗病相關的候選基因。本研究以3個環(huán)境的黃萎病抗性相對病情指數(shù)為表型值進行關聯(lián)分析，結果發(fā)現(xiàn)能夠在兩個以上環(huán)境中檢測到的位點有11個（其中有2個位點能同時在3個環(huán)境中檢測到），有1個位點BNL3280與前人通過連鎖分析方法得到QTL具有相同的關聯(lián)性狀^[9]，其余10個標記位點可能為新開發(fā)的標記位點。這些標記可為進一步理解棉花抗黃萎病性狀的遺傳機理提供理論依據(jù)，并可為后期棉花抗黃萎病分子標記輔助選擇育種提供標記來源；另外，本研究發(fā)掘出含有優(yōu)異等位變異的典型材料7份，其中來源于黃河流域棉區(qū)的‘魯棉研28’同時含有9個優(yōu)異等位變異，進一步結合不同生態(tài)區(qū)來源種質資源優(yōu)異等位變異出現(xiàn)的頻率，發(fā)現(xiàn)來源于黃河流域棉區(qū)的材料與來源其他棉區(qū)的材料相比具有較低的平均表型效應，說明來源于黃河流域棉區(qū)的材料具有較強的抗黃萎病性，并可作為優(yōu)良親本資源或供體材料用于西北內陸棉區(qū)抗黃萎病棉花新品種選育研究。

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Association Analysis of" SSR Markers with Verticillium

Wilt Resistance Traits in Upland Cotton

WANG Juan ZHEN Zhihong²，MA Xiaomei ZHOU Xiaofeng WANG Xin

TIAN Qin AI Nijiang²，CHEN Hong¹ and DONG Chengguang¹

（1.Cotton Research Institute，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences，Shihezi" Xinjiang

832000，China;" 2.Shihezi Academy of Agricultural Sciences，Shihezi" Xinjiang 832000，China）

Abstract A genome-wide association study （GWAS） was conducted to identify marker loci，elite alleles and typical accessions associated with Verticillium wilt resistance in upland cotton.These findings provide a theoretical basis for molecular breeding to enhance disease resistance.In this study，403 upland cotton lines were analyzed using 201 pairs of polymorphic SSR markers covering the whole genome.A mixed linear model （MLM） was applied to three environmental datasets.The average Verticillium wilt disease index was 53.45，with an average coefficient of variation of 36.85%，skewness of -0.46，and kurtosis of -0.31.A total of 394 allelic variation loci were detected，among which 11 loci were consistently identified in two environments，and two loci （NAU2437b and NAU3493b） wereidentified in all three environments.Seven typical accessions containing elite alleles were discovered，" among whichLuxianyan 28" contained nine elite alleles.Materials from the Yellow River Region exhibited lower average phenotypic effects，indicating potential for targeted breeding in this area.

Key words Upland cotton;Verticillium wilt; SSR association analysis; Elite allele

Received" 2023-08-02 Returned 2024-03-26

Foundation item The Science and Technology Innovation Talent Program of The Xinjiang Production and Construction Corps （No.2022CB003-04）; The Science and Technology Project of Sixth Division of Xinjiang Production and Construction Corps （No.2205）; Key Field Science and Technology Development Program of Eighth Division of Xinjiang Production and Construction Corps （No.2023NY10）.

First author WANG Juan，female，associate research fellow.Research area：cotton genetics and breeding.E-mail：cottonwj@126.com

Correspondingauthor" DONG Chengguang，male，research fellow.Research area：cotton genetics and breeding.E-mail：dcg318@163.com

CHEN Hong，female，research fellow.Research area：cotton genetics and breeding.E-mail：xjchenh990122@163.com

（責任編輯：成 敏 Responsible editor：CHENG" Min）