驢源馬鏈球菌馬亞種的分離鑒定及生物學特性分析

摘 要 為探究新疆喀什某驢場驢腺疫病的病原菌及其相關(guān)生物學特性，應(yīng)用綿羊鮮血培養(yǎng)基對采集樣品進行細菌的分離純化，通過革蘭氏染色、鏡檢及PCR擴增對分離菌進行鑒定，并利用 MEGA 7.0生物軟件繪制分離菌的遺傳進化樹；繪制分離菌生長曲線，通過分離菌體內(nèi)致病性試驗、毒力基因檢測試驗以及藥物敏感性試驗等對分離菌進行生物學特性分析。結(jié)果顯示，獲得一株具有 β溶血特性且革蘭氏染色陽性的鏈球菌，測序結(jié)果通過GenBank的Blast比對，與已注冊馬鏈球菌馬亞種同源性高達99.01%，遺傳進化樹分析發(fā)現(xiàn)該分離菌與新疆馬鏈球菌馬亞種HTP133（MT815602.1）遺傳距離最近，命名為LXY019株；從生長曲線可以看出該分離菌在培養(yǎng)8 h后達到平臺期，18 h后走向衰亡；致病性試驗結(jié)果顯示，分離菌對小鼠的LD50為" 1.58×10⁷ CFU/mL，毒力基因鑒定結(jié)果提示該分離菌攜帶fneB和seM；藥敏試驗結(jié)果顯示該分離菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素高度敏感，對氨基苷類抗生素的敏感性相對較低。以上結(jié)果表明，分離純化的驢源馬鏈球菌馬亞種對小鼠具有明顯的致病性，臨床治療可優(yōu)先選用 β-內(nèi)酰胺類抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，結(jié)果可以為驢源馬鏈球菌馬亞種感染引起的驢腺疫的防治提供參考。

關(guān)鍵詞 驢腺疫；馬鏈球菌馬亞種；致病性；毒力基因；藥物敏感性

馬鏈球菌馬亞種（Streptococcus equi subspecies.equi，S. equi）是引起腺疫的主要病原菌，可導致馬屬動物體溫升高、呼吸道炎癥并分泌黏性及膿性分泌物、下頜淋巴結(jié)腫脹等^[1]，馬鏈球菌馬亞種對外界環(huán)境抵抗力較強 ^[2]，最早被鑒定于1888年^[3]。2018年山東省的6 個養(yǎng)驢場爆發(fā)了腺疫，中國首次分離獲得驢源馬鏈球菌馬亞種，研究發(fā)現(xiàn)，1 歲以下驢的發(fā)病率 （40.3%）和死亡率顯著高于成年驢^[4]。同年，新疆和田市某驢場從山東等地區(qū)引進的8 000多頭肉驢感染腺疫^[5]。除此之外，河南、河北、遼寧、山西、陜西、內(nèi)蒙、甘肅等多個地區(qū)先后爆發(fā)驢腺疫^[6]。目前，該病已成為危害中國馬屬動物養(yǎng)殖業(yè)的主要細菌性傳染病，給養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失。

馬鏈球菌馬亞種的天然宿主為馬屬動物，馬腺疫的報道比較頻繁，但近些年關(guān)于馬鏈球菌馬亞種感染驢的報道逐漸增多^[7]。因此，通過對驢腺疫分離菌進行遺傳進化分析，有利于追溯該驢場感染腺疫的傳播途徑，進行分離菌致病性及毒力基因攜帶情況分析，可評估驢源馬鏈球菌馬亞種的危害性，藥物敏感性檢測可為有效防控該病原菌引起的疾病提供參考。因此，對從新疆喀什澤普縣驢場分離鑒定獲得的一株馬鏈球菌馬亞種進行致病性、毒力基因及藥物敏感性進行研究，旨在闡明驢源馬鏈球菌馬亞種的危害性，尋找抵抗該病原菌的有效防控措施。

1 材料與方法

1.1 病料來源及基本信息

新疆喀什澤普縣某驢場的驢群出現(xiàn)精神沉郁，飲食欲減退，結(jié)膜潮紅，流黃白色膿性鼻液，下頜淋巴結(jié)稍微腫大，體溫升高，糞便干燥、排便減少，尿少而黃等癥狀，采集患病驢鼻拭子48份，" 4 ℃條件下送至新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院中獸醫(yī)學實驗室。

1.2 試驗動物及供試菌株

25只SPF級KM小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，" 6 周齡，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。馬源馬鏈球菌馬亞種（SEE-M）和馬鏈球菌馬亞種標準菌ATCC9528均保存于新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院中獸醫(yī)學實驗室。

1.3 主要試劑

脫纖維綿羊鮮血、革蘭氏染色試劑盒、TE緩沖液均購自北京索萊寶科技有限公司；2×Es Taq Master Mix（Dye）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；藥敏紙片購自杭州濱和生物公司；瓊脂粉、THB培養(yǎng)基均購自青島海博生物科技有限公司。

1.4 疑似菌的分離及鏡檢

將3 mL生理鹽水加入每份鼻拭子收集管后室溫震蕩混勻，取400 μL混合液加入THB液體培養(yǎng)基（1∶10）中，37 ℃ 、180 r/min振蕩培養(yǎng)" 18～24 h，即得受試菌液；接種環(huán)蘸取受試菌液，劃線接種于50 mL/L綿羊鮮血固體培養(yǎng)基上，" 37 ℃、倒置培養(yǎng)18 h，挑取 β溶血的單菌落繼續(xù)重復上述操作3次，進行細菌純化，至鮮血培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)單一、穩(wěn)定，挑取鮮血平板上針尖大小、 β溶血的單菌落于載玻片上，經(jīng)革蘭氏染色后于油鏡下觀察。

1.5 分離菌的16S" rDNA序列測定及分析

挑取一個在50 mL/L綿羊鮮血培養(yǎng)基上純化完成的單菌落于20 μL TE buffer中，吹打混勻，PCR儀95 ℃ 5 min ，得到菌體DNA作為模板，進行PCR擴增（正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，" 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸" 10 min。反應(yīng)結(jié)束，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。若出現(xiàn)1 466 bp目標片段，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果于NCBI的BLAST進行比對，確定是否為馬鏈球菌馬亞種。

1.6 分離菌的生長曲線繪制

將活化好的驢源分離菌、馬源菌（SEE-M）及ATCC9528標準菌液加入透明試管內(nèi)，對比0.5麥氏比濁管，用生理鹽水稀釋至1×10⁶CFU/mL，取800 μL稀釋菌液加入8 mL THB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 h檢測菌液在D600nm處的吸光度，以時間為橫軸、D600nm吸光度為縱軸繪制3株菌的生長曲線圖。

1.7 分離菌的小鼠致病性試驗

昆明小鼠25只，小鼠隨機分成5組（Ⅰ～Ⅴ）。將活化好的驢源分離菌接種于4 mL THB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，用生理鹽水將菌液稀釋成4個濃度組（Ⅰ 組：1×10⁹ CFU/mL；Ⅱ組：1×10⁸ CFU/mL；Ⅲ組：1×10⁷ CFU/mL；Ⅳ組：1×10⁶ CFU/mL）及1個空白對照組（Ⅴ組：生理鹽水），各組按照每只0.5 mL劑量進行腹腔注射。觀察動物 7 d 內(nèi)的死亡狀況，記錄小鼠的臨床癥狀（精神狀態(tài)、被毛、飲食欲）及死亡情況，用改良Karber法計算分離菌對小鼠的半數(shù)致死量（LD50），繪制小鼠死亡曲線，稱量小鼠體質(zhì)量。

1.8 分離菌的毒力基因檢測

對驢源分離菌進行相關(guān)毒力基因鑒定，毒力基因及引物序列通過相關(guān)文獻獲取（表1），主要為鏈球菌自溶素（autolysin of Streptococcus pneumomiae，lytA）、透明質(zhì)酸裂解酶（hyaluronidase，hylB）、鏈球菌溶血素（pneumolysin，ply）、類M蛋白（M-like protein，seM）和纖黏蛋白結(jié)合蛋白（Fibronectin Binding Protein ，fneB）^[8-9]，通過PCR進行鑒定。

1.9 分離菌的藥物敏感性檢測

將活化好的驢源分離菌、馬源馬鏈球菌馬亞種（SEE-M）及標準菌ATCC9528菌液用生理鹽水稀釋至1×10⁶ CFU/mL。吸取100 μL稀釋好的菌液均勻涂布于THB固體培養(yǎng)基表面，采用K-B紙片瓊脂擴散法，分析3株菌對氨芐西林、頭孢噻肟、克拉霉素、紅霉素、慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、環(huán)丙沙星等藥物的敏感性。設(shè)置3組平行對照， 37 ℃孵育18～24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 疑似菌的分離及鏡檢結(jié)果

從48份驢鼻拭子樣品中共分離出1株疑似馬鏈球菌，分離菌在50 mL/L綿羊鮮血培養(yǎng)基上形成針尖大小、白色半透明、有明顯 β溶血特征的菌落（圖1-A），革蘭氏染色結(jié)果為陽性，顯微鏡下觀察呈短鏈狀（圖1-B）。根據(jù)以上形態(tài)特征，筆者懷疑分離菌為馬鏈球菌。

2.2 分離菌16S rDNA序列擴增及測序分析

以分離菌株基因組DNA為模板，用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，在1 466 bp處出現(xiàn)特異性條帶（圖2），測序結(jié)果通過NCBI的BLAST比對發(fā)現(xiàn)，分離菌與已注冊馬鏈球菌馬亞種的同源性達99.01%，結(jié)合菌落形態(tài)和染色鏡檢結(jié)果，確定該分離菌為馬鏈球菌馬亞種。

2.3 分離菌遺傳進化樹的繪制及分析

用MAGE 7.0繪制遺傳進化樹，發(fā)現(xiàn)分離菌與新疆馬鏈球菌馬亞種HTP133（MT815602.1）遺傳距離最近（圖3），處于同一分支，將本次分離株命名為驢源馬鏈球菌馬亞種LXY019株。

2.4 分離菌LXY019株的生長曲線

由生長曲線可知（圖4），LXY019株接種8 h為對數(shù)生長期，8 h之后穩(wěn)定生長，18 h后進入衰亡期，SEE-M株于前8 h呈對數(shù)生長，8 h后穩(wěn)定生長，呈衰亡趨勢，但不明顯，標準菌ATCC9528在THB液體培養(yǎng)基內(nèi)前2 h生長迅速，2 h后緩慢生長，20 h后呈衰亡趨勢。

2.5 分離菌LXY019株對小鼠的致病性試驗

如表2所示，腹腔注射第1 天，Ⅰ 組小鼠全部死亡；第2 天，Ⅱ 組小鼠死亡2 只，至第7 天全部死亡；其余接種組（Ⅲ組、Ⅳ組）小鼠均出現(xiàn)不同程度患病癥狀，如精神狀態(tài)差，被毛粗亂，食欲廢絕等，但至第7 天未見死亡；Ⅴ組小鼠無任何異常表現(xiàn)。剖檢死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)其肺泡充血嚴重，肝臟、腎臟和脾臟有不同大小的病灶，無菌采集死亡小鼠內(nèi)臟涂擦于TSA平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，于心、肝、脾、肺、腎中分離到與LXY019株菌落形態(tài)大小一致的細菌菌落（圖5）。

根據(jù)公式LD50=lg^-1[Xm-i（ΣP-0.5）]，計算得到分離菌LXY019株對小鼠的半數(shù)致死量為1.58×10⁷ CFU/mL。

2.6 分離菌LXY019株毒力基因檢測

對驢源分離菌LXY019株進行相關(guān)毒力基因檢測，5種毒力基因鑒定結(jié)果顯示，LXY019株攜帶FneB和SeM毒力基因（表3）。

2.7 分離菌LXY019株藥物敏感性檢測

根據(jù)抑菌圈大小（表4），確定驢源分離菌LXY019株對氨芐西林、頭孢噻肟、克拉霉素、紅霉素、慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、環(huán)丙沙星7 種藥物高度敏感；SEE-M對氨芐西林、頭孢噻肟、克拉霉素、紅霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星5 種藥物高度敏感，對四環(huán)素中介敏感，對阿米卡星存在耐藥性；標準菌ATCC9528對氨芐西林、頭孢噻肟、克拉霉素、紅霉素、慶大霉素、阿米卡星、四環(huán)素、環(huán)丙沙星7種藥物高度敏感。

3 討" 論

中國是世界主要產(chǎn)驢國之一，養(yǎng)殖歷史悠久，隨著養(yǎng)驢業(yè)的發(fā)展，新疆驢存欄量持續(xù)增長，已高達126.06萬頭，自2018年山東省驢場暴發(fā)腺疫以來，中國關(guān)于腺疫的報道愈發(fā)頻繁，新疆驢產(chǎn)業(yè)也受到影響，存欄量降到前所未有的低谷（14.77萬頭）^{[ 10]}。Waller^[11]研究認為，處在感染馬鏈球菌馬亞種表現(xiàn)癥狀前的馬屬動物傳播腺疫的概率遠遠高于患病動物通過化膿性分泌物傳播的概率，驢源引進是導致腺疫感染的主要途徑，由于個體差異問題，一些抵抗力較高的病原攜帶者或者處于潛伏期的感染者，通過癥狀表現(xiàn)不能判斷是否被感染^[12]，而驢流通范圍的擴大，將增加感染腺疫的幾率，給驢產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

從新疆喀什澤普縣某驢場患病驢病料中分離獲得透明針尖大小、有β溶血環(huán)的菌株，革蘭氏染色呈藍色短鏈狀，符合馬鏈球菌馬亞種形態(tài)特征^[13-14]，分離菌株16S rDNA測序比對確定，該驢場驢群為馬鏈球菌馬亞種感染所致的腺疫，遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)病原分離菌LXY019與2021年新疆馬鏈球菌馬亞種分離菌HTP133遺傳距離" 最近。

相關(guān)研究表明，HTP133株與美國馬鏈球菌馬亞種（Streptococcus equi subsp.equi strain，ATCC 33398）同源性較高^[7，15]。歷史記載中國家驢主要產(chǎn)自非洲，經(jīng)由西亞和東亞，傳至中國新疆^[16] 。從1995年起至今，新疆先后引進了新吉爾吉斯馬、英純血馬、美國速步馬等^[17]，這可能是分離株LXY019與英國馬鏈球菌馬亞種同源性高的原因。

fneB、seM、hylB、lytA和ply是馬鏈球菌馬亞種常見的毒力基因，其編碼的蛋白分別為纖黏蛋白結(jié)合蛋白、類M蛋白、透明質(zhì)酸裂解酶、鏈球菌自溶素、鏈球菌溶血素，其中纖黏蛋白結(jié)合蛋白可與機體內(nèi)的纖黏蛋白結(jié)合，助力病原菌在機體內(nèi)侵襲擴散^[18-19]；類M蛋白能夠與纖維蛋白原和免疫球蛋白結(jié)合，抑制吞噬作用^[20-23]，達到感染動物機體的目的；透明質(zhì)酸裂解酶在馬鏈球菌馬亞種進入集體后，降解透明質(zhì)酸，使病原菌迅速滲入組織，順利達到侵襲目的^[24-26]；鏈球菌自溶素可使菌體發(fā)生自溶，導致胞內(nèi)多種毒素（如鏈球菌溶血素等）釋放以危害宿主，同時還可干擾機體的免疫系統(tǒng)，協(xié)助病原菌逃避免疫^[27-28]；鏈球菌溶血素是一種胞內(nèi)蛋白，屬于膽固醇結(jié)合毒素，與宿主細胞表面的膽固醇結(jié)合后使細胞溶解，對宿主危害極大^[29-30]。根據(jù)對驢源馬鏈球菌馬亞種分離菌的5種相關(guān)毒力基因檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)驢源分離菌LXY019株攜帶有兩種毒力基因（fneB和seM基因），孫丹嵐等^[8]對馬鏈球菌進行7種毒力基因鑒定，其中三種毒力基因被表達，攜帶fneB基因的分離株最多，其次為lytA和ply，結(jié)合小鼠致病性試驗結(jié)果（分離菌LXY019株對小鼠的半數(shù)致死量LD50=1.58×10⁷ CFU/mL），推測驢源分離菌LXY019株依靠類M蛋白在機體內(nèi)抵抗吞噬，通過纖黏蛋白結(jié)合蛋白達到侵襲擴散作用，當進入機體的細菌達到一定量時，將會導致動物機體產(chǎn)生病理反應(yīng)，甚至死亡。

根據(jù)3株馬鏈球菌馬亞種藥物敏感性結(jié)果，驢源分離菌LXY019株對抗生素的敏感性普遍高于其他兩株保存菌株，3株菌均對β-內(nèi)酰胺類抗生素（氨芐西林、頭孢噻肟）和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（克拉霉素、紅霉素）敏感，而對四環(huán)素和氨基苷類抗生素（阿米卡星、慶大霉素）的敏感性相對較低。黃榮等^[31]研究表明，青海驢腺疫分離菌對 β-內(nèi)酰胺類抗生素高度敏感；王寧等^[14]研究發(fā)現(xiàn)，驢腺疫分離菌對 β-內(nèi)酰胺類抗生素（頭孢曲松、苯唑西林）、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（紅霉素）和人工合成類抗生素（利福平）敏感；多種研究均表明，馬腺疫鏈球菌對青霉素等抗生素敏感^[32]。由此可見，在治療該馬鏈球菌馬亞種引起的腺疫時，可選用 β-內(nèi)酰胺類抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進行有效治療。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究分離的驢源馬鏈球菌馬亞種LXY019株與2021年新疆馬鏈球菌馬亞種分離菌HTP133遺傳距離相近，攜帶fneB和seM基因，對小鼠有一定的致病性，臨床治療推薦選用 β-內(nèi)酰胺類抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。研究結(jié)果可以為驢源馬鏈球菌馬亞種感染的驢腺疫防治及其新藥研發(fā)提供參考。

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Isolation and Identification of Strain of Streptococcus equi Subspecies.

equi" from Donkey and Analysis of Its Biological Characteristics

LI Jinrong ²，ZHANG Wei ²，HAO Baoshan ²，WANG Xin ²，

GAO Hanya ²，XULI Yina ²，JIE Zhenghao ABULA" Saifuding ²，WUSIMAN Adelijiang ²，KUANG" Ling ²and LIU Dandan ²

（1.Institute of Animal Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;

2.Xinjiang Key Laboratory of Herbivore Drug Research and Creation，Urumqi 830052，China）

Abstract Toexplore the pathogenic bacteria and related biological characteristics of donkey strangles in a donkey farm in Kashgar，Xinjiang，bacteria from collected samples using sheep fresh blood culture medium were isolated and purified. The isolated bacteria were identified through Gram staining，microscopy，and PCR amplification. MEGA 7.0 biological software was used to draw the genetic evolution tree of isolated bacteria，and the growth curve of isolated bacteria was drawn and their biological characteristics were analyzed through conducting in vivo pathogenicity tests，virulence gene detection tests，and drug sensitivity tests. The results the isolation of a strain of streptococci with" β-hemolytic properties and a positive Gram stain. The sequencing results were compared with GenBank’s" Blast and showed a high homology of 99.01% with the registered Streptococcus equi subspecies. equi. The genetic evolution tree analysis indicated that the genetic distance between the isolates of Streptococcus equi subspecies. equi from the donkey and the isolates of Streptococcus equi subspecies. equi from Xinjiang HTP133（MT815602.1） was similar，the isolates were named LXY019 strain.The growth curve showed that the isolated bacteria reached a plateau period after 8 hours and began to decline after 18 hours. Pathogenicity results indicated that the LD50 of the isolated strain in mice was1.58× 10⁷ CFU/mL. Virulence gene identification indicated that the isolated strain carried fneB and seM. The final drug sensitivity test results showed that the isolated bacteria were sensitive to" β-Lactam antibiotics and macrolide antibiotics were highly sensitive，while aminoglycoside antibiotics were relatively insensitive. These findings showed that the" Streptococcus equi subspecies isolated and purified from donkeys exhibits obvious pathogenicity in mice，and" β-lactam antibiotics and macrolide antibiotics are recommended for clinical treatment. The results provide a reference for the prevention and treatment of donkey strangles caused by this pathogen.

Key words Donkey strangles;Streptococcus equi subspecies. equi; Pathogenicity; Virulence genes; Drug sensitivity

Received" 2023-10-21 Returned 2023-12-05

Foundation item Youth Fund of Xinjiang Autonomous Region" （No. 2023D01B31）; Special Fund for Central Government Guids Local Science and Technology Development （No. ZYYD2023C03）; Graduate Research Innovation Project of Xinjiang Agricultural University （No. XJAUGRI2023012）; 2023 Innovation Project for College Students （No. 2022SJKF45）.

First author LI" Jinrong，female，master" student.Research area：pharmacology and immunology of traditional Chinese veterinary medicine. E-mail：li_98208@163.com

Correspondingauthor ZHANG Wei，male，Ph.D，associate professor.Research area：veterinary parasitology. E-mail：zw2017xjau@163.com

LIU Dandan，female，master，lecturer，master supervisor.Research area：pharmacology and immunology of traditional Chinese veterinary medicine. E-mail：liudandanxjau@163.com

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）