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    百香果SUS基因家族鑒定與表達分析

    2024-12-31 00:00:00包雨瑩彭先蕊潘若云任銳方庭
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2024年11期
    關鍵詞:高溫脅迫表達分析百香果

    摘要:百香果(Passiflora edulis Sims)雖原產(chǎn)熱帶地區(qū),但高溫也會影響其開花坐果,進而影響產(chǎn)量。果實糖含量不僅影響果實風味品質,還可以作為滲透調(diào)節(jié)物質參與高溫、干旱、鹽害等逆境脅迫。蔗糖合成酶(sucrose synthase,SUS)是蔗糖代謝的關鍵酶之一,在植物糖積累及非生物脅迫響應中具有重要功能。對百香果SUS基因家族成員進行鑒定和生物信息學分析,并分析其在低溫脅迫下的表達變化。運用生物信息學方法,對百香果蔗糖合成酶基因進行全基因組鑒定與基因結構、系統(tǒng)發(fā)育關系、蛋白質保守功能域、染色體定位分析,利用轉錄組數(shù)據(jù)分析其表達模式,利用qRT-PCR技術分析其在高溫處理下的表達。結果顯示,百香果中包含5個SUS基因,分布在4條染色體上,外顯子數(shù)量為13~15個。5個SUS基因家族成員可分為三大類,即SUSⅠ、SUSⅡ、SUSⅢ,百香果SUS基因家族成員啟動子中含有激素響應、逆境響應相關的順式作用元件。表達模式分析表明,PeSUS3基因在百香果葉片和果皮中的表達量均較高。qRT-PCR分析表明,PeSUS1、PeSUS2基因在高溫處理后表達量顯著下降,PeSUS5基因表達量顯著性上升,說明PeSUS1、PeSUS2、PeSUS5基因可能在百香果高溫脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

    關鍵詞:百香果;蔗糖合酶;高溫脅迫;表達分析

    中圖分類號:S667.901文獻標志碼:A

    文章編號:1002-1302(2024)11-0045-06

    百香果(Passiflora edulis Sims)是西番蓮科西番蓮屬藤本植物,別名雞蛋果、洋石榴等,原產(chǎn)于大、小安的列斯群島,目前廣泛種植于我國廣東、海南、福建、云南、臺灣等省份[1]。百香果具有很高的食用、觀賞和藥用價值,近年來在我國熱帶和亞熱帶地區(qū)得到廣泛推廣[2-3]。

    可溶性糖含量是果實風味品質形成的主要因素,果實中的可溶性糖主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖等[4-5]。高等植物在進行光合作用的過程中會產(chǎn)生大量蔗糖,蔗糖合成酶(sucrose Synthase,SUS)則在植物蔗糖代謝生理過程中發(fā)揮關鍵作用,對蔗糖的轉運和積累有著重要影響[6]。蔗糖合成酶最早是在小麥胚芽中被發(fā)現(xiàn)的[7],主要起分解蔗糖的作用,參與植物生長發(fā)育的多個過程,如源、庫組織之間蔗糖的分配[8]、淀粉的生物合成[9]、植物纖維素的合成[10]、非生物脅迫響應[11]等。

    近年來,隨著測序技術的飛速發(fā)展,許多植物的基因組信息被破譯,為SUS基因家族成員的鑒定奠定了基礎。陳成等從海沃德獼猴桃基因組中鑒定出7個SUS成員,發(fā)現(xiàn)AdSUS2.2與果實中蔗糖、果糖、葡萄糖含量的相關性最高,說明其是調(diào)控獼猴桃果實蔗糖合成積累的重要基因[12]。王亞娜等鑒定了6個檸檬蔗糖代謝關鍵酶ClSUS基因家族成員,qRT-PCR分析表明,ClSUS4基因對檸檬果實可溶性糖積累可能具有重要作用[13]。呂佳紅等從梨中鑒定出17份SUS基因家族成員,qRT-PCR分析、調(diào)控網(wǎng)絡分析表明,PbrSUS2、PbrSUS15可能參與調(diào)控梨果實的蔗糖合成與積累[14]。

    百香果基因組測序在2021 年完成[1],這表明在全基因組水平上進行百香果相關基因家族分析成為可能。何銳杰等從百香果基因組中鑒定出11個CHS基因家族成員,發(fā)現(xiàn)PeCHS基因在果皮顏色的形成及逆境脅迫條件下發(fā)揮重要作用[15]。Liang等研究鑒定了138個百香果bHLH基因家族成員,篩選出可能調(diào)控不同花器官和果實發(fā)育的PebHLHs基因,其中許多基因在不同脅迫處理下存在表達差異[16]。百香果SUS基因家族成員的鑒定與分析迄今未見報道。本研究基于基因組信息對百香果SUS基因家族成員進行鑒定,分析其在高溫脅迫下的表達變化,以期為百香果SUS基因功能的進一步研究提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗時間和地點

    試驗于2023年4—5月在福建農(nóng)林大學園藝學院園藝植物細胞與分子遺傳學實驗室完成。

    1.2 百香果SUS基因家族成員的鑒定

    從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫TAIR(https://www.arabidopsis.org/)獲取擬南芥SUS蛋白序列,從國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺(China National GeneBank DataBase,CNGBdb)獲取百香果基因組序列[1]。選用模式植物擬南芥的SUS基因成員蛋白序列為query,在百香果的蛋白質數(shù)據(jù)庫中進行同源對比,條件設定為E值lt;1×10-5,篩選出百香果SUS基因家族候選序列,進一步利用NCBI-CCD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和Pfam數(shù)據(jù)庫(https://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/pfam/#table)對其結構域進行鑒定,將僅含有蔗糖合成酶結構域(sucrose-synth,PF00862)和糖基轉移酶結構域(glycos-transf-1,PF00534) 的蛋白序列作為百香果SUS基因家族候選序列[17]。

    1.3 百香果SUS基因編碼的蛋白質理化性質分析

    運用TBtools軟件進行百香果蔗糖合成酶(SUS)蛋白理化性質分析。通過DeepTMHMM(https://dtu.biolib.com/DeepTMHMM)、SignalP-4.1(https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)、WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/) 在線軟件,分別預測蛋白跨膜結構、信號肽、亞細胞定位情況。

    1.4 百香果SUS基因的染色體定位、基因結構、系統(tǒng)進化和保守motif分析

    運用MG2C(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)網(wǎng)站在線分析預測百香果SUS家族成員的染色體定位;運用TBtools軟件分析百香果SUS家族成員的基因結構;運用MEME Suite在線軟件(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)預測百香果SUS蛋白保守Motif圖,Motif 數(shù)量設置為8,其余參數(shù)默認不作設置。將擬南芥、水稻的SUS基因家族成員與百香果的進行多序列比對后,利用 MEGA 11軟件構建進化樹,Bootstrap重復1 000次,其余參數(shù)默認不作設置。

    1.5 百香果SUS基因啟動子的順式作用元件分析

    利用Tbtools 提取基因成員轉錄起始位點上游2 000 bp 的序列,利用 P1antCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 進行PeSUS基因順式作用元件預測,并進一步利用Tbtools進行數(shù)據(jù)可視化處理。

    1.6 百香果SUS基因家族成員的表達模式分析

    基于從NCBI獲得的公共轉錄組數(shù)據(jù)(PRJNA634206)和筆者所在課題組保存的百香果轉錄組數(shù)據(jù),分析百香果SUS基因家族成員在不同品種果皮和葉片中的表達模式?;贔PKM(每 1 000 個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片)定量分析各基因表達水平,并利用TBtools軟件繪制表達熱圖。

    1.7 百香果SUS基因在高溫處理下的表達分析

    對苗齡為2個月的欽蜜9號百香果幼苗進行40 ℃高溫脅迫處理6 h,以28 ℃生長的植株為對照,處理、對照各設3株。處理完成后,取相同部位的百香果葉片樣品并立即用液氮冷凍,在-80 ℃保存?zhèn)溆谩2捎锰旄萍迹ū本┯邢薰镜腞NAprep Pure多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取RNA;cDNA合成按照TransGen的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進行[15]。選用Pe60S基因作為內(nèi)參基因[18],采用實時熒光定量 PCR 檢測各基因的表達量水平,所用引物序列見表1。所用試劑為SYBR GreenⅠ Master Mix (TaKaRa),所用儀器為LightCycler 96 Real-Time PCR Systems(Roche)。使用2-ΔΔCT方法[19]計算相對表達量,并利用SPSS軟件中的Duncan’s新復極差法對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析。利用Prism 9軟件繪制柱形圖。

    2 結果與分析

    2.1 百香果SUS基因家族成員的鑒定

    由表2可知,從百香果基因組中鑒定出5個SUS成員,命名為PeSUS1~PeSUS5。其中PeSUSs基因長度為3 968~6 765 bp;但其編碼區(qū)長度變化較小,為2 391~2 520 bp。G+C含量為0.40~042,A+T含量為0.58~0.60。

    2.2 百香果SUS蛋白理化性質分析

    由表3可知,PeSUS5基因有最少的氨基酸數(shù)(796個)、分子量(91 523.73 u),PeSUS2有最多的氨基酸數(shù)(839個)、分子量(96 524.79 u);蛋白質等電點在5.37~6.89之間,均<7,說明均為酸性蛋白;5個家族成員的不穩(wěn)定系數(shù)均在40以下,說明這些蛋白質較穩(wěn)定,其中PeSUS2基因具有最強的穩(wěn)定性;脂肪系數(shù)為84.50~94.64;平均親水性系數(shù)均為負值,說明百香果SUS基因家族蛋白均為親水性蛋白;由亞細胞定位分析可見,百香果SUS基因表達產(chǎn)物大部分定位于細胞質中,因此可推測該家族蛋白主要參與胞質基因組轉錄調(diào)控。

    2.3 百香果SUS基因家族染色體定位分析

    如圖1所示,百香果5個SUS基因分布在1、4、6、9號染色體上,其中9號染色體上有2個成員,其余3條染色體上各含有1個成員。

    2.4 百香果SUS基因家族成員的基因結構及編碼的蛋白質的保守基序分析

    如圖2所示,百香果SUS基因家族成員含有內(nèi)含子數(shù)量較多,介于12~14個之間;其中PeSUS3基因最多,含有14個,PeSUS2基因最少,含有12個。

    由圖3可知,百香果SUS基因家族成員之間所包含的保守基序的種類、數(shù)量、位置均存在不同程度的差異,大致可分為3類,成員PeSUS1包含 Motif 1~Motif 11、Motif 13~ Motif 17、Motif 19;成員PeSUS3、PeSUS4相較于成員PeSUS1多了Motif 18;成員PeSUS2、PeSUS5相較于成員PeSUS3、PeSUS4多了Motif 20。其中 Motif 1~Motif 11、Motif 13~ Motif 17、Motif 19的保守性最高,因此Motif 1~Motif 11、Motif 13~ Motif 17、Motif 19是百香果蔗糖合酶基因編碼蛋白的重要組件。

    2.5 百香果SUS基因家族的進化分析

    將擬南芥SUS基因家族、水稻SUS基因家族、百香果SUS基因家族成員進行多序列比對,其進化樹如圖4所示。結果顯示,SUS基因家族共分為3個亞家族,其中PeSUS2、PeSUS4、PeSUS5屬于SUSⅠ亞家族,PeSUS1屬于SUSⅢ亞家族,PeSUS3屬于SUSⅡ亞家族。

    2.6 百香果SUS基因家族成員啟動子的順式作用元件分析

    如圖5所示,PeSUS基因家族共鑒定出16種不同順式作用元件,包括參與干旱誘導MYB結合位點、低溫、分生組織表達、光、茉莉酸甲酯、胚乳表達、赤霉素、創(chuàng)傷、缺氧特異性誘導增強子、防御和脅迫、生長素、水楊酸、脫落酸、厭氧誘導、蛋白質結合位點和玉米代謝順式作用元件,大致可分為3類,即生長發(fā)育相關、激素相關、逆境相關,表明PeSUS家族在百香果的不同生長階段以及應對不同的環(huán)境條件都具有重要的作用。其中,生長發(fā)育相關的順式作用元件占比最多,尤其是光順式作用元件,說明PeSUS家族對百香果生長發(fā)育調(diào)控具有重要作用。

    2.7 百香果SUS基因家族成員的組織表達模式分析

    如圖6所示,百香果SUS各基因在葉片中的表達量有差別,其中PeSUS3基因的表達量最高,PeSUS5基因的表達量位于其次,PeSUS1、PeSUS2基因的表達量較低,PeSUS4基因在葉片中幾乎不表達;推測PeSUS3對百香果葉片生長具有一定作用。5個成員在不同發(fā)育時期果實果皮中的表達趨勢與葉片中基本一致。

    2.8 百香果SUS基因在高溫處理下的表達分析

    如圖7所示,對欽蜜9號百香果進行6 h的高溫脅迫處理后,對其PeSUS基因進行表達分析。其中,PeSUS1、PeSUS2基因的表達量均顯著下調(diào)(Plt;0.05),PeSUS5基因的表達量極顯著上調(diào)(Plt;001);而PeSUS3基因的表達量有所下降,PeSUS4基因的表達量有所上升,但兩者表達量變化均無顯著性差異。

    3 討論

    本研究發(fā)現(xiàn),百香果SUS基因家族中含有5個成員,其數(shù)量與目前已發(fā)現(xiàn)的一些物種相似,即擬南芥有6個[17]、水稻有7個[20]、檸檬有6個[13]、辣椒有5個[21]等。5個家族成員基因結構相似,進化分析結果顯示,百香果中的SUS成員分為3個亞家族,類似的結果在擬南芥[17]、豌豆[9]、無籽蜜柚[22][JP+1]中都有發(fā)現(xiàn)。基因的組織表達模式與其功能特征密切相關,利用轉錄組數(shù)據(jù)開展的基因表達模式分析表明,PeSUS3基因在百香果2個品種的葉片、果皮中表達量均最高,推測此基因在百香果生長發(fā)育過程中可能擔任較為重要的角色,但未來還需進一步探究該基因的具體生理作用和調(diào)控機制等。

    前人的相關研究已經(jīng)表明,SUS家族成員在植物逆境脅迫中發(fā)揮重要作用,例如BoSUS1a、BoSUS1b基因表達水平在低溫處理后的耐冷甘藍CT-923葉片中急劇升高[23],干旱脅迫下發(fā)菜Sus2在轉錄水平的表達量逐漸增加[24]。部分研究的啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn),百香果SUS基因家族成員啟動子存在大量的逆境響應元件,暗示該家族基因可能也會參與百香果的逆境脅迫響應。高溫處理后PeSUS1、PeSUS2基因的表達量顯著下降,PeSUS5基因的表達量極顯著上升,說明PeSUS1、PeSUS2、PeSUS5基因在高溫脅迫中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

    本研究從百香果基因組中鑒定出5個PeSUS基因家族成員, 其編碼的氨基酸具有不同的理化性質。系統(tǒng)進化樹顯示5個PeSUS蛋白被分為3個亞家族,且亞家族Ⅰ中包含3個成員。PeSUS3基因在2個品種葉片和果皮中的表達量最高,很可能在百香果葉片蔗糖合成和運輸中發(fā)揮作用。PeSUS3基因的生物學功能還需進一步研究驗證,期待本研究結果可為PeSUS候選基因功能的深入研究提供理論基礎,為百香果的分子育種提供一定的理論依據(jù)和基因資源。

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