茶樹RCI2基因家族成員的鑒定及其低溫脅迫下表達分析

摘要：茶樹具有較高的經(jīng)濟價值，而低溫脅迫不僅會影響茶葉的產(chǎn)量和質量，還會導致經(jīng)濟效益下降，因此茶樹抗低溫育種研究迫在眉睫。稀有冷誘導（RCI2）基因是一類與低溫脅迫密切相關的基因，目前有關茶樹低溫脅迫的研究并不太多，本研究團隊首次通過生物信息學手段從茶樹基因組中鑒定出11個RCI2基因，并對基因的氨基酸序列、保守結構域及啟動子順式作用元件和低溫脅迫表達模式等進行分析。通過氨基酸序列比對和基序分析，發(fā)現(xiàn)茶樹RCI2基因結構高度保守；啟動子順式作用元件分析結果顯示，大部分茶樹RCI2基因含有如ARE、ABRE等與抗逆相關的啟動子順式作用元件，相關基因可能具有較強的抗應激能力并參與復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。低溫脅迫下基因的轉錄豐度分析結果顯示，CsRCI2B、CsRCI2D、CsRCI2I和CsRCI2J都受到低溫誘導表達，而qRT-PCR分析結果顯示，CsRCI2B、CsRCI2J在低溫脅迫下6 h、7 d時的表達量顯著升高，CsRCI2I在低溫脅迫下7 d時的表達顯著受到抑制，表明上述3個基因可能參與低溫脅迫響應途徑。通過突變位點數(shù)量統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，CsRCI2B、CsRCI2I和CsRCI2J的變異位點分別有90、96、79個，突變位點遠少于大部分基因，表明這些基因結構穩(wěn)定，可能在進化過程中規(guī)避了有害突變并在茶樹體內(nèi)發(fā)揮重要作用。研究結果初步證實，茶樹CsRCI2B、CsRCI2I和CsRCI2J響應低溫脅迫并具有潛在的重要作用，也為后續(xù)茶樹抗逆育種研究提供參考信息和信息支撐。

關鍵詞：茶樹；RCI2基因；低溫脅迫；突變；表達分析

中圖分類號：Q786；S794.4" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）19-0057-07

收稿日期：2024-04-09

基金項目：信陽農(nóng)林學院林學院/信陽市林木遺傳育種重點實驗室項目。

作者簡介：張畢陽（1986—），男，河南信陽人，博士，講師，研究方向為草地生物多樣性。E-mail：175332224@qq.com。

通信作者：李文楊，碩士，副教授，研究方向為經(jīng)濟林豐產(chǎn)栽培及逆境生理研究。E-mail：wylee126@126.com。

低溫脅迫是影響作物產(chǎn)量的重要因素，茶樹經(jīng)受低溫脅迫后，會大大限制其產(chǎn)量。其次，伴隨著環(huán)境的變化，茶樹不僅會逐漸適應，而且由于環(huán)境變化通常對植物的生長、發(fā)育和繁殖造成壓力，也會促使植物在適應過程中推動本身的進化^［1］。在非生物脅迫中，溫度及干旱脅迫具有更大的普遍性，相關研究更有意義，目前普遍認為，非生物脅迫會影響植物生長發(fā)育并導致植物在分子層面的基因表達發(fā)生變化^［2］。為了更好地分析植物內(nèi)在的基因進化情況，可以通過高通量測序分析植物基因是否發(fā)生變異以及用K_a/K_s（氨基酸替代率與同義替代率的比值）衡量基因演化過程中的選擇壓力，從而進一步分析植物在非生物脅迫下是否會發(fā)生進化^［3-4］。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，基因的插入與缺失、SNP和InDel在植物中可以對基因表達產(chǎn)生影響，這可能導致植物性狀發(fā)生變化^［5-6］?；虻耐蛔円约安迦牒腿笔Э梢杂绊懟虻墓δ堋⒄{(diào)控區(qū)域、表達水平等，從而影響植物的生長、發(fā)育、抗病性等性狀^［7-8］。結合以上方法，可以在分析時結合基因的功能、進化壓力和物種間的差異，以更全面地理解基因演化的動力學^［9］。

稀有冷誘導（RCI2）基因是一類高度保守并高度疏水的小分子蛋白質編碼基因，一般認為它們具有2個跨膜結構域（TMDs），同時大部分RCI2基因具有親水性C端尾部，目前已知它們與非生物脅迫密切相關。RCI2基因最初在小麥草中發(fā)現(xiàn)，起初由于在小麥草中響應早期鹽脅迫誘導而被命名為ESI3^［10］。目前關于RCI2基因的研究已經(jīng)涉及較多植物，如擬南芥、玉米和小麥等，從其結構到功能及機制探究等都有相關報道^［11-13］。關于RCI2基因，Rocha已對其表達進行了相關論述^［14］，不僅分析了其在不同物種中具有多功能性，如AtRCI2A、AtRCI2B可能在低溫或其他環(huán)境條件導致的水分脅迫下作為膜蛋白穩(wěn)定劑參與植物應對低溫脅迫的途徑^［15］；經(jīng)過藥理學過程處理后進行活細胞成像發(fā)現(xiàn)，RCI2基因對溫度脅迫具有獨特的特征，推測RCI2基因在不同溫度變化下的表達翻譯具有很大動態(tài)變化。上述研究得出結論，RCI2主要參與非生物脅迫中與溫度相關的調(diào)控機制。AtRCI2A、AtRCI2B可能在低溫或其他環(huán)境條件導致的水分脅迫下作為膜蛋白穩(wěn)定劑。此外，最近有報道顯示，RCI2基因通過FM464、NaCl等藥理學過程進行活細胞成像，使RCI2基因對溫度脅迫具有獨特的應對特征^［16-17］。因此，研究RCI2基因在冷熱等不同應力條件下的動態(tài)變化，可能為RCI2依賴的應力耐受性提供新的機制。結合RCI2基因的功能分析，推測基因在植物非生物脅迫下的表達發(fā)生變化，植物在長期生長過程中，大多數(shù)基因不僅會在短期應激非生物脅迫，也會對反反復復的脅迫產(chǎn)生記憶，進而進行一場長期的應答過程，在這個過程中，植物接受了大量外部壓力，從而會使植物發(fā)生基因突變，進而進化。在研究中，通常需要結合更多試驗和數(shù)據(jù)，如表達譜、功能試驗和突變分析，以全面理解基因的演化、表達和功能之間的關系。

茶樹［Camellia sinensis（L.） O. Ktze.］原產(chǎn)于東亞，目前在世界范圍內(nèi)廣泛種植，茶含有多酚類化合物和咖啡堿等，同時兼具抗氧化、抗衰老、治療疾病等多種醫(yī)學功效，因而深受大眾喜愛，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。非生物脅迫會影響茶樹的產(chǎn)量、質量^［18-19］。本研究基于對茶樹中RCI2基因的首次鑒定分析，并進行進化分析/選擇壓力分析和非生物脅迫下的表達模式分析，同時參考數(shù)據(jù)庫，分析基因在進化過程中氨基酸的插入與缺失，深度解析茶樹基因在非生物脅迫下可能存在的進化關系，以期為了解茶樹如何進化及篩選抗逆性較強的茶樹品種提供支撐信息。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗材料采自信陽農(nóng)林學院教學實踐園，于2024年3月在實踐園區(qū)選取生長狀態(tài)良好、長勢基本一致的2年生福鼎大白茶樹進行處理，設置如下人工氣候室生長條件：溫度（24±2） ℃，濕度 65%。以未進行4 ℃處理的植株作為對照（CK），以于4 ℃處理7 d為處理組，同時設置處理后恢復7 d的處理。收集每種處理后的1芽3葉（混樣），每個處理保持3個生物學重復，取樣后用液氮速凍并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 茶樹RCI2基因家族成員的鑒定

從擬南芥信息資源（TAIR；http：//www.arabidopsis.org/）中下載8個已報道的擬南芥RCI2蛋白序列作為查詢序列在茶樹中進行同源BlastP。在Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)中下載PMP3結構域隱馬爾可夫模型（PF01679），按E值lt;10^-10對茶樹基因組進行檢索^［20］。為了進一步篩選候選基因，將所得基因的蛋白序列上傳至Pfamscan（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/pfamscan/）與NCBI-CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）上，以E值lt;10^-10進行檢索，根據(jù)檢索結果查看基因是否含有PMP3結構域。同時，使用DNAMAN軟件對氨基酸序列進行比對，以確定基因結構無誤。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析和K_a/K_s壓力分析

使用MEGA 6.0軟件，用Neighbour-Joining（NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹并進行bootstrap測試（n=1 000），進化樹使用Evolview（https：//evolgenius.info//evolview-v2）在線工具進行美化。基因之間的重復事件使用DNASP 6.0軟件計算非同義突變頻率（K_a）、同義突變頻率（K_s）和非同義突變頻率與同義突變頻率的比值（K_a/K_s）。

1.4 茶樹RCI2基因基序與啟動子順勢作用元件分析

使用MEME （https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在線分析網(wǎng)站對RCI2基因的保守基序進行鑒定，參數(shù)配置參照之前的研究方法。使用TBtools提取目的基因啟動子前2 000 bp序列，并將RCI2基因啟動子序列提交至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），用于鑒定順勢作用元件。使用TBtools軟件對結果進行作圖^［21］。

1.5 熱圖構建及qRT-PCR分析

基因表達數(shù)據(jù)來源于安徽農(nóng)業(yè)大學茶樹基因組公共數(shù)據(jù)庫（http：//tpia.teaplants.cn/）^［22］，使用TBtools軟件對數(shù)據(jù)進行可視化處理。RNA提取使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（北京華越洋生物技術有限公司）提取，引物設計用Primer 5.0設計。以CsPTB-RT作為茶樹內(nèi)部對照的特異性引物（表1）。實時熒光定量系統(tǒng)：1 μL cDNA模板，10 μL SYBR Premix ExTaq（TaKaRa，Kyoto，Japan），2 μL 特異性引物，7 μL ddH₂O。PCR熱循環(huán)參數(shù)如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，45個循環(huán)。在信陽農(nóng)林學院公共試驗平臺上，使用ABI Step One Plus熒光定量系統(tǒng)對來自不同節(jié)點樣品的cDNA進行實時熒光定量PCR分析。

1.6 基于全基因組測序的變異位點分析

在茶樹基因組變異數(shù)據(jù)庫（http：//www.teaplant.top/teagvd）^［23］中檢索目的基因變異位點情況并統(tǒng)計目的基因變異位點數(shù)量，統(tǒng)計基因變異位點的插入與缺失氨基酸數(shù)量。

2 結果與分析

2.1 茶樹RCI2基因成員的鑒定

從茶樹CSS（cv.Shuchazao）基因組中共鑒定出11個RCI2基因，基于進化分析及染色體位置，將這些基因重新命名為CsRCI2A～CsRCI2K。在茶樹中，RCI2基因分布于5條染色體上，2個基因未組裝，基因氨基酸序列長度為54～72 aa，相對分子量為5.95～8.07 ku，等電點為4.00～8.35，大部分基因都編碼酸性蛋白（表2）。此外，茶樹CsRCI2基因的平均親水性整體上大于1，基因均編碼疏水性蛋白。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了分析基因的功能，還對這些基因進行進化樹的構建，通過進化分析找到相似性較大的基因并對其進行功能上的推測，對茶樹、擬南芥RCI2基因氨基酸序列進行進化樹的構建。對茶樹RCI2基因的氨基酸序列與擬南芥RCI2的氨基酸序列進行共同比對發(fā)現(xiàn)，基因PMP3保守結構域高度保守（圖1）。由圖2可見，基因之間的同源性相對來說較高，并且在不同物種間同源性較高的基因也可能具有相似功能。

2.3 CsRCI2基因的保守基序和基因結構分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，CsRCI2基因的基序數(shù)量為4個，所有基因都高度保守并含有基序1、基序2，部分基因特異性包含基序3、基序4。因此，茶樹CsRCI2基因在進化發(fā)育過程中的差異性可能較低。通過外顯子-內(nèi)含子結構的進一步分析還可以發(fā)現(xiàn)，CsRCI2基因大多只有1個內(nèi)含子（圖3），基因結構相對簡單，基因之間的相似性可能較大。

2.4 基因共線性分析和進化選擇壓力分析

K_a/K_s通常被用來衡量基因的選擇壓力，筆者通過DNASP 6.0軟件進行相關預測，結果顯示，茶樹RCI2基因之間有2對基因具有復制事件產(chǎn)生，其中CsRCI2B～CsRCI2A基因對之間的復制事件是片段復制事件，K_a/K_slt;1，比較特殊的是CsRCI2C～CsRCI2K基因對的K_s值為0（表3）。

2.5 茶樹CsRCI2基因啟動子的順式作用元件

為了進一步分析CsRCI2基因在低溫脅迫下可能存在的響應機制，筆者對CsRCI2基因上游2 kb的啟動子序列進行順式作用元件分析。結果表明，共有262個順式作用元件，分析其功能可以將其分為3類，分別是脅迫相關（干旱誘導、厭氧誘導、缺氧特異誘導性、防御和壓力反應、低溫響應）、發(fā)育相關（玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控、分生組織表達、晝夜節(jié)律控制、胚乳表達、種子特異性調(diào)控、類黃酮生物合成基因調(diào)控、柵欄葉肉細胞、光響應元件）、激素相關（赤霉素反應、水楊酸反應、脫落酸反應、MeJA響應、生長素反應）的順式作用元件（圖 4）。結果表明，11個基因都含有數(shù)量不等的非生物脅迫相關順式作用元件 9個基因含有1個或多個ARE順式作用元件，2個基因含有低溫響應元件LTR，8個基因含有脫落酸響應順式作用元件（ABRE）。眾所周知，ABRE、MBS、LTR這幾種順式作用元件在非生物脅迫下的轉錄調(diào)控中發(fā)揮至關重要的作用。此外，大部分基因在生長發(fā)育及與激素相關的順式作用元件上都有分布，說明在茶樹中CsRCI2基因參與了復雜的轉錄調(diào)控網(wǎng)絡。

2.6 基因表達模式分析及qRT-PCR分析

為了初步分析基因在低溫脅迫下的表達模式，并從表達模式中分析基因在壓力狀況下可能具有的相似性，從安徽農(nóng)業(yè)大學茶樹基因組公共數(shù)據(jù)庫下載低溫下基因的FPKM表達數(shù)據(jù)，并構建了熱圖進行分析。圖5結果顯示，CsRCI2B、CsRCI2D、CsRCI2I和CsRCI2J這4個基因在低溫處理下均受到誘導表達，而且這些基因隨著不同處理時間的變化及不同組織間的轉錄豐度變化都表現(xiàn)出很大的差異，如CsRCI2B、CsRCI2D和CsRCI2J在低溫處理不同階段的表達量顯著上升，表明這些基因可能在低溫脅迫下正向調(diào)節(jié)低溫脅迫，同時CsRCI2I的表達量在低溫處理下顯著下降，表明CsRCI2I可能在低溫脅迫下負調(diào)控。

為了進一步分析候選基因是否受低溫誘導并在低溫脅迫下發(fā)揮作用，對候選基因進行qRT-PCR分析，結果顯示，CsRCI2B、CsRCI2J的表達量分別在處理6 h、7 d時顯著升高（圖6-A、圖6-D），而 CsRCI2D的表達量在低溫處理下沒有發(fā)生顯著變化，CsRCI2I在低溫處理后7 d的表達量出現(xiàn)顯著下降（圖6-B、圖6-C）。結合轉錄組數(shù)據(jù)的分析結果表明，CsRCI2B和CsRCI2J可能在低溫脅迫下正向調(diào)控低溫脅迫，CsRCI2I可能在茶樹中是1個響應低溫的負調(diào)控因子。

2.7 基因變異位點統(tǒng)計

選擇壓力分析和表達分析只能初步分析基因是否介導非生物脅迫，但是基因在非生物脅迫下是否會介于壓力的存在導致突變（如氨基酸的插入與缺失），這一點并不能完全確認。因此，筆者在茶樹基因組變異數(shù)據(jù)庫中檢索了所有茶樹RCI2基因的氨基酸插入與缺失情況，發(fā)現(xiàn)CsRCI2B、CsRCI2D、CsRCI2I、CsRCI2J和CsRCI2H這5個基因的總變異數(shù)量低于100，其他基因的變異數(shù)量介于109～323（表4）。

3 討論

目前已知RCI2在擬南芥、水稻、玉米、棉花和紫花苜蓿中都已完成鑒定^［24-25］。本研究通過鑒定，共發(fā)現(xiàn)11個茶樹RCI2基因，并對其進行進化分析、基因結構分析、啟動子順式作用元件分析及表達分析和變異位點分析，希望通過對這些基因的分析發(fā)現(xiàn)茶樹在非生物脅迫下進化的痕跡。系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示，CsRCI2A、CsRCI2B和擬南芥的AtRCI2A、AtRCI2B高度相似。已有研究發(fā)現(xiàn)，AtRCI2A、AtRCI2B參與低溫脅迫，結合在低溫和PEG處理下的表達分析結果，認為CsRCI2A、CsRCI2B可能參與非生物脅迫?；驈椭剖腔蚨鄻踊幕A，從而實現(xiàn)遺傳新穎性，基因復制也是物種進化與適應的主要來源^［26］。K_a/K_s分析結果顯示，CsRCI2B、CsRCI2A在進化過程中，基因的功能在演化過程中相對穩(wěn)定，基因可能會保持相對穩(wěn)定的表達水平，同時變異的積累相對較小，不會導致劇烈的功能改變。上述結果表明，CsRCI2A、CsRCI2B可能和擬南芥AtRCI2A、AtRCI2B一樣在茶樹非生物脅迫下發(fā)揮重要核心功能。

在基因基序和結構分析發(fā)現(xiàn)，基因結構相對簡單，同時內(nèi)含子數(shù)量相對較少，而較少的內(nèi)含子表明基因具有更強的抗應激能力，可以快速激活基因的轉錄表達，而CsRCI2基因大多只有1個內(nèi)含子，表明CsRCI2基因也可能具有較強的應激能力，這在其他物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)相關證據(jù)，如研究人員發(fā)現(xiàn)在紫花苜蓿中MsRCI2A、MsRCI2B和MsRCI2C基因受低溫誘導，轉基因植株也具有更強的耐冷性^［25］。通過對啟動子順式作用元件的分析，也可以找到CsRCI2基因可能在低溫等非生物脅迫下可能具有功能的證據(jù)，11個基因中不僅含有數(shù)量不等的脅迫相關順式作用元件，還含有激素相關的順式作用元件，這與陸地棉的研究結果類似，二者都發(fā)現(xiàn)MBS、LTR和ARE脅迫相關的順式作用元件^［24］。上述結果也證明，CsRCI2基因可能在非生物脅迫下參與非常復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。

結合基因表達分析、qRT-PCR分析和突變位點數(shù)量分析，發(fā)現(xiàn)CsRCI2B、CsRCI2I和CsRCI2J不僅在不同脅迫下具有較高的轉錄豐度，同時這些基因都具有較少的變異位點，因此推測這些基因在受到低溫脅迫后的進化過程中發(fā)生了氨基酸的突變，并且基因不僅保持了結構穩(wěn)定，沒有太多變異位點，而且在茶樹體內(nèi)發(fā)揮了重要作用，規(guī)避了有害突變。因此，在茶樹中的RCI2基因在外部環(huán)境影響下可能大部分出現(xiàn)功能退化，而核心基因沒有發(fā)生過多有害突變，并可在植物受到低溫脅迫后發(fā)揮重要作用。

4 結論

植物基因在面對長期外部環(huán)境壓力時可能經(jīng)歷表達和進化的調(diào)整，以適應新的環(huán)境條件。這種響應通常是植物適應性演化的一部分，旨在提高生存和繁殖的成功率?；蚪Y構和啟動子順式作用元件分析結果顯示，茶樹RCI2基因結構高度保守，同時這些基因在茶樹受到低溫脅迫時可能具有較強的抗應激能力并參與復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。結合對茶樹RCI2基因進化和在低溫脅迫下的表達分析結果，可以看出茶樹CsRCI2B、CsRCI2I 和CsRCI2J可能通過其差異表達來應對外部環(huán)境壓力。上述基因在長期壓力下可能導致適應性表達水平的提高，這些基因可能參與低溫脅迫響應途徑?；虻淖儺愇稽c統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，長期的外部環(huán)境壓力可能引起自然選擇，促使帶有有益變異的個體在群體中的相對頻率提高。同時茶樹中大多數(shù)RCI2基因的變異是不利于其進化的，因為只有變異位點相對較少的基因在低溫脅迫下展現(xiàn)出高表達。本研究結果為CsRCI2基因在低溫脅迫下的研究提供了信息支撐，也為后續(xù)茶樹抗逆育種提供了參考信息。

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