超聲波輔助提取野山竹多酚工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

摘要：以野山竹果殼為原料，進(jìn)行野山竹多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性的研究，建立以單寧酸溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林酚法和分光光度法測定野山竹多酚含量的定量分析方法。結(jié)果顯示：在提取時間35 min、超聲溫度70 ℃、提取pH 5、料液比1∶65（g/mL）、超聲功率400 W的條件下多酚提取得率可高達(dá)0.73%。野山竹多酚對1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）和羥基自由基（·OH）均有較強(qiáng)的清除效果，最大清除率分別為84.2%和82.0%。

關(guān)鍵詞：野山竹；多酚；提取工藝；抗氧化性；清除率

中圖分類號：TS201.1""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）09-0186-06

Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction Process of Polyphenols from

Garcinia oblongifolia and Study on Antioxidant Activity

TANG Ting-fan， LI Xue-song， HUANG Ying-feng， TIAN Yu-hong， XU Zi-wei， CHENG Hao*

（Guangxi Liuzhou Luosifen Engineering Technology of Research Center， Guangxi Key Laboratory of

Green Processing of Sugar Resources， College of Biological and Chemical Engineering，

Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545006， China）

Abstract： With the shell of Garcinia oblongifolia as the raw material， the extraction process of polyphenols from Garcinia oblongifolia is optimized and their antioxidant activity is investigated， and a quantitative analytical method is established to determine the polyphenol content of Garcinia oblongifolia with tannic acid solution as the standard by Folin-Ciocalteu method and spectrophotometry. The results show that under the conditions of extraction time of 35 min， ultrasonic temperature of 70 ℃， extraction pH of 5， solid-liquid ratio of 1∶65 （g/mL） and ultrasonic power of 400 W， the polyphenol extraction yield could be as high as 0.73%. The Garcinia oblongifolia polyphenols show strong scavenging effects on both 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical （DPPH·） and hydroxyl radical （·OH）， with the maximum scavenging rates of 84.2% and 82.0% respectively.

Key words： Garcinia oblongifolia; polyphenol; extraction process; antioxidant activity; scavenging rates

收稿日期：2024-01-21

基金項目：廣西自然科學(xué)基金面上項目（2021GXNSFAA220067）；廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目（YCSW204511）；國家自然科學(xué)基金項目（22268012）

作者簡介：唐婷范（1988—），女，高級實驗師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化工。

*通信作者：程昊（1980—），男，副研究員，碩士，研究方向：應(yīng)用化學(xué)。

野山竹也叫嶺南山竹子（Garcinia oblongifolia），是藤黃科藤黃屬植物[1]，山竹殼占山竹總重的60%以上，直接丟棄不僅浪費(fèi)資源，而且會危害環(huán)境[2]，因此，充分利用這些食品副產(chǎn)品并提高其資源利用率是必要可行的。山竹殼粗提取物中除含有多酚類物質(zhì)外，還含有氧雜蒽酮類、三萜類以及黃酮類化合物[3-6]。多酚是一種天然的抗氧化劑，具有抗氧化[7]、抗炎[8]、抑制α-葡萄糖苷酶[9]、抗菌[10-11]和抗腫瘤活性[12]。

傳統(tǒng)提取方法如有機(jī)溶劑萃取法、滲透提取法和水浴回流提取法等存在一些缺點(diǎn)，如提取出的所需成分的含量遠(yuǎn)低于預(yù)期的含量，提取物中摻雜的其他成分多，提取效果不好。而新的提取方法包括超聲輔助提取法[13-14]、超臨界流體萃取法[15]、微波萃取法[16-17]具有提取物純度高、提取時間短、節(jié)能和提取效率高等優(yōu)點(diǎn)[18]。本試驗采用超聲波提取野山竹殼中的多酚，采用福林酚法和分光光度法測定了野山竹殼中多酚類物質(zhì)的含量，考察了料液比、超聲功率、超聲溫度、超聲時間和蒸餾水pH 5個因素對多酚得率的影響，對野山竹殼粗提物中的多酚提取工藝及其抗氧化性能進(jìn)行了初步研究，有助于野山竹資源在食品領(lǐng)域的合理開發(fā)和利用，可以增加產(chǎn)品的多樣性，提高食品的營養(yǎng)價值，增強(qiáng)抗氧化能力，同時也能有效利用其副產(chǎn)品資源，為食品行業(yè)的發(fā)展創(chuàng)造更多的機(jī)遇和可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野山竹果殼：廣西北海；單寧酸（分析純）：天津市鼎盛鑫化工有限公司；福林酚試劑（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；鹽酸（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（分析純）：WaKo公司；水楊酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸亞鐵（分析純）：臺山市粵僑化工廠；無水乙醇、過氧化氫（均為分析純）：成都市科隆化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

V2000型紫外可見分光光度計 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；AR124CN電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；BPG-9240A精密鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHB-ⅢS型循環(huán)水式真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Alpha 1-4 LD Plus真空冷凍干燥機(jī) 德國Marin Christ公司；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DXF-200C/D密封型搖擺式粉碎機(jī) 廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 野山竹的預(yù)處理

將野山竹殼洗凈，放入干燥箱中于40 ℃烘干，用粉碎機(jī)粉碎后用保鮮袋包裝保存，備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取0.010 0 g單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品，將其溶解于超純水中，將溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加入適量超純水使總體積達(dá)到100 mL，得到濃度為0.1 mg/mL的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用移液管從單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中取出2.00 mL，并將其轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中。隨后，加入1.50 mL的福林酚試劑和2.00 mL的10%碳酸鈉溶液。最后，加入適量的蒸餾水使總體積達(dá)到25 mL，在避光條件下靜置30 min后，在波長700～850 nm范圍內(nèi)測量其吸光度。同時，以超純水作為空白參比。為進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，準(zhǔn)備5個25 mL容量瓶，分別向其中移取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 mL的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次加入1.50 mL福林酚試劑和2.00 mL 10%碳酸鈉溶液，并在避光條件下靜置30 min進(jìn)行顯色反應(yīng)。在波長785 nm處測量吸光度，并進(jìn)行3次平行測量取平均值。同時，使用0.00 mL超純水作為空白參比。以單寧酸溶液的濃度（C）作橫坐標(biāo)，吸光度（A）作縱坐標(biāo)繪制單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 精密度試驗

稱量1.0 g野山竹粉于錐形瓶中，加入固定料液比的蒸餾水，在特定的超聲溫度、功率、時間下進(jìn)行提取，抽濾后得到提取液。用吸量管移取2.00 mL提取液于25 mL容量瓶中，按照步驟“1.3.2”反應(yīng)顯色，顯色后連續(xù)6次測量吸光度。

1.3.4 穩(wěn)定性試驗

從提取液中取出2.00 mL樣品，并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中。按照步驟“1.3.2”反應(yīng)顯色，顯色后連續(xù)6次（間隔2 min）測量吸光度。

1.3.5 多酚得率的測定

在波長785 nm處進(jìn)行多酚含量的測定時，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線確定吸光度與多酚濃度之間的關(guān)系，并使用回歸方程計算待測樣品中多酚的含量。通過得率公式計算出樣品中多酚的得率，以表征實際提取過程中多酚的回收效率。

多酚得率（%）=A－0.03669.813×V×n1 000×m×100%。

式中：A為吸光度值；V為提取液體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g；1 000為換算系數(shù)。

1.3.6 單因素試驗考察

1.3.6.1 料液比

準(zhǔn)確稱取1.0 g預(yù)處理好的野山竹粉，按照所選的料液比準(zhǔn)備相應(yīng)的提取樣品，將其放入超聲波提取裝置中，控制提取時間為35 min、提取溫度為50 ℃、超聲功率為350 W，選擇1∶25、1∶35、1∶45、1∶55、1∶65 5個不同的料液比水平，對每個料液比水平進(jìn)行3次平行試驗。

1.3.6.2 超聲功率

準(zhǔn)確稱取1.0 g預(yù)處理好的野山竹粉，按照所選的料液比準(zhǔn)備相應(yīng)的提取樣品，將其放入超聲波提取裝置中，控制提取時間為35 min、提取溫度為50 ℃、料液比為1∶55，選擇300，350，400，450，500 W 5個不同的超聲功率水平，對每個超聲功率水平進(jìn)行3次平行試驗。

1.3.6.3 提取時間

準(zhǔn)確稱取1.0 g預(yù)處理好的野山竹粉，按照所選的料液比準(zhǔn)備相應(yīng)的提取樣品，將其放入超聲波提取裝置中，控制料液比為1∶55、提取溫度為50 ℃、超聲功率為350 W，選擇15，25，35，45，55 min 5個不同的提取時間水平，對每個提取時間水平進(jìn)行3次平行試驗。

1.3.6.4 提取溫度

準(zhǔn)確稱取1.0 g預(yù)處理好的野山竹粉，按照所選的料液比準(zhǔn)備相應(yīng)的提取樣品，將其放入超聲波提取裝置中，控制料液比為1∶55、提取時間為35 min、超聲功率為350 W，選擇40，50，60，70，80 ℃ 5個不同的提取溫度水平，對每個提取溫度水平進(jìn)行3次平行試驗。

1.3.6.5 溶劑pH

準(zhǔn)確稱取1.0 g預(yù)處理好的野山竹粉，按照所選的料液比準(zhǔn)備相應(yīng)的提取樣品，將其放入超聲波提取裝置中，控制料液比為1∶55、提取時間為35 min、提取功率為350 W、提取溫度為50 ℃，選擇3，4，5，6，7 5個不同的pH水平，對每個pH水平進(jìn)行3次平行試驗。

1.3.7 野山竹多酚提取條件工藝優(yōu)化

在試驗過程中，設(shè)置不同的料液比、提取時間、超聲功率和提取溫度，并記錄每組試驗條件下的多酚得率。通過統(tǒng)計分析，確定對多酚得率影響顯著的因素。使用正交試驗優(yōu)化多酚提取的最佳參數(shù)組合。根據(jù)正交表中的試驗數(shù)據(jù)，分析不同試驗條件下的多酚得率，并確定對多酚提取效果影響最大的條件組合。利用Origin 2022和Excel軟件制作圖表，以展示試驗數(shù)據(jù)和分析結(jié)果。通過分析正交表中的試驗數(shù)據(jù)，研究各個因素對得率的影響趨勢，并通過制圖來直觀地呈現(xiàn)這些趨勢，了解不同因素對得率的影響程度，并找出其中最顯著的因素。

1.3.8 抗氧化作用

配制不同質(zhì)量濃度的水溶液，分別運(yùn)用Fenton法與DPPH法[19]測定各試樣不同濃度時的A517 nm與A510 nm，并計算其對DPPH·和·OH的清除率。

2 試驗結(jié)果

2.1 單寧酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收光譜見圖1。

由圖1可知，在波長785 nm處單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液有最大吸收峰。在785 nm處測定不同濃度下的吸光度，擬合數(shù)據(jù)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

由試驗可知，用Origin擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為A=69.812 5C+0.036 0，相關(guān)系數(shù)R2為0.998 7。在2～18 μg/mL濃度范圍內(nèi)，吸光度值與單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度試驗

對提取液進(jìn)行精密度試驗，測得數(shù)據(jù)見表1。

根據(jù)試驗結(jié)果，在顯色反應(yīng)30 min后，連續(xù)進(jìn)行6次吸光度測定，并計算得到吸光度的平均值為0.537。通過計算，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.18%，說明試驗數(shù)據(jù)的重復(fù)性非常好，結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性高。

2.3 穩(wěn)定性試驗

對提取液進(jìn)行穩(wěn)定性試驗，測得數(shù)據(jù)見表2。

每隔2 min測量吸光度，平均吸光度值為0.492，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.89%，穩(wěn)定性相對較好，為減少試驗結(jié)果的誤差，應(yīng)該保證每次顯色時間相同時測量。

2.4 單因素對野山竹多酚提取得率的影響

2.4.1 料液比對野山竹多酚得率的影響

由圖3可知，當(dāng)料液比在1∶25～1∶65之間時，野山竹殼多酚的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。特別是當(dāng)料液比在1∶25～1∶35范圍內(nèi)，多酚得率的上升幅度非常顯著。在料液比為1∶55時有峰值，此時野山竹多酚的得率達(dá)到0.505%。當(dāng)料液比繼續(xù)增加時，多酚得率的增長逐漸變緩，在達(dá)到峰值后開始下降。原因可能是溶劑量少時，多酚的濃度大，使得野山竹殼中的多酚溶出慢，且溶出得不完全；當(dāng)加大溶劑的量時，多酚濃度降低，增加了濃度差，加快了多酚從原料到水中的擴(kuò)散速度；當(dāng)溶劑增加到一定量后，多酚基本溶出，多酚濃度隨著料液比的增加有所降低，所以得率呈下降趨勢。從節(jié)約資源的角度出發(fā)，選擇料液比為1∶55進(jìn)行以下單因素試驗。

2.4.2 提取時間對野山竹多酚得率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的增加，多酚的得率不斷上升，當(dāng)提取時間達(dá)到35 min后，得率開始趨于穩(wěn)定，且在35 min時有最大得率0.498%。當(dāng)提取時間在15～30 min之間時多酚得率上升趨勢很明顯，30 min后上升趨勢較之前緩慢，35 min后趨于平緩，多酚得率升高是因為在35 min前野山竹殼中多酚不斷溶出，35 min時已經(jīng)基本達(dá)到最大量，所以多酚得率不再升高，為了有效減少試驗時間，選擇35 min為最優(yōu)提取時間。

2.4.3 超聲功率對野山竹多酚得率的影響

由圖5可知，當(dāng)超聲功率在300～500 W范圍內(nèi)，多酚得率呈現(xiàn)先緩慢上升后快速下降的趨勢。當(dāng)超聲功率在300～400 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增大，多酚的得率呈現(xiàn)明顯的增加趨勢。當(dāng)超聲功率逐漸增大時，超聲波的能量傳遞和作用效果也會相應(yīng)增強(qiáng)。初始階段緩慢上升可能是由于超聲波引發(fā)的機(jī)械剪切力和渦流效應(yīng)促進(jìn)了樣品的混合和質(zhì)量傳遞，從而有利于多酚的釋放和溶解。然而，隨著超聲功率繼續(xù)增加，空化作用和機(jī)械作用變得更加劇烈。過高的超聲功率會導(dǎo)致局部溫度升高和壓力變化，甚至可能引發(fā)樣品的破裂或損壞。因此，過高的超聲功率反而不利于多酚的提取，導(dǎo)致得率下降。超聲功率為400 W時，多酚得率達(dá)到最大，為0.496%。當(dāng)超聲功率在300～400 W之間，增加超聲功率會導(dǎo)致更強(qiáng)烈的液體振動和微小氣泡的形成與坍塌，從而在野山竹殼中產(chǎn)生更多的機(jī)械振動能量，促進(jìn)多酚的釋放和溶解。這種空化作用和機(jī)械作用可以有效地破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和纖維素等復(fù)雜組分，提高多酚的釋放和溶解效率，進(jìn)而增加多酚的得率。超聲功率超過400 W后，隨著超聲功率增大，得率反而下降，可能是因為超聲功率過大導(dǎo)致多酚不穩(wěn)定而被破壞[20]。因此，選擇400 W為最優(yōu)超聲功率。

2.4.4 提取溫度對野山竹多酚得率的影響

由圖6可知，當(dāng)提取溫度在40～80 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，多酚的得率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。尤其在40～70 ℃之間，多酚得率上升的趨勢非常明顯。溫度的升高可以促進(jìn)樣品中多酚的溶解和擴(kuò)散。當(dāng)溫度升高時，樣品分子的熱運(yùn)動增加，有利于多酚與提取劑的相互作用，從而促進(jìn)多酚的釋放和溶解。隨著溫度的升高，多酚的得率持續(xù)增加，在70 ℃時達(dá)到最大值，為0.61%。而溫度過低時多酚沒有完全溶出，溫度過高導(dǎo)致溶出的多酚結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[21]，理化性質(zhì)也有了變化，多酚被高溫破壞而含量下降。

2.4.5 溶劑pH對野山竹多酚得率的影響

由圖7可知，在pH 3～7的酸性范圍內(nèi)，多酚的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在pH 5時得率達(dá)到最大值0.553%，多酚在偏酸性介質(zhì)中可以保持穩(wěn)定，在堿性介質(zhì)中容易氧化[22]，在pH 5之后多酚得率下降，原因是pH升高，多酚氧化。

2.5 正交試驗設(shè)計結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，通過正交試驗找出最優(yōu)的因素和相鄰的兩組試驗條件，選取的水平見表3。

在多酚提取過程中，通過正交試驗系統(tǒng)地研究不同因素對多酚得率的影響，結(jié)果見表4。

由表4可知，各因素對野山竹殼多酚得率的影響程度為料液比＞提取溫度＞溶液pH＞超聲功率。綜合考慮后得各因素的最佳水平組合為A2B2C3D3，即超聲溫度70 ℃、溶劑pH 5、料液比1∶65、超聲功率400 W。經(jīng)過3次驗證試驗，在此工藝條件下，從野山竹殼中提取多酚的得率為0.73%。

2.6 抗氧化作用試驗結(jié)果

由圖8可知，單寧酸標(biāo)準(zhǔn)液和樣液對DPPH·的清除率均呈上升趨勢，但是單寧酸標(biāo)準(zhǔn)液的上升趨勢不明顯，最高清除率為87.1%；樣液在濃度為0.5～2.0 mg/mL內(nèi)上升趨勢很明顯，在濃度超過2.0 mg/mL后對DPPH·的清除率開始趨于穩(wěn)定，最高清除率為84.2%。

由圖9可知，單寧酸標(biāo)準(zhǔn)液和樣液對·OH的清除率均隨著濃度的增加而升高。在濃度為0.5～1.5 mg/mL范圍內(nèi)，兩者的清除率增加趨勢最顯著。然而，在濃度超過1.5 mg/mL后，兩者的清除率增幅開始趨于平緩。單寧酸標(biāo)準(zhǔn)液的清除率在濃度達(dá)到1.5 mg/mL后達(dá)到100%，而樣液的清除率雖然在上升，但趨于穩(wěn)定。這可能是因為樣液在試驗范圍內(nèi)對羥基自由基的清除能力已經(jīng)接近一個定值。試驗結(jié)果顯示，在濃度為2.5 mg/mL時，樣液具有最大的清除率，達(dá)到82%。

3 結(jié)論

本試驗采用超聲提取法研究了料液比、提取時間、超聲功率和提取溫度這4個因素對野山竹殼多酚提取工藝的影響，同時初步研究了野山竹殼多酚的抗氧化性能。試驗結(jié)果表明，野山竹殼中含有多酚類抗氧化成分，而在最佳工藝條件下，多酚的得率為0.73%。在試驗濃度范圍內(nèi)，野山竹殼多酚提取液表現(xiàn)出了顯著的抗氧化能力，其對·OH和DPPH·的清除率分別達(dá)到82.0%和84.2%。野山竹殼多酚提取液具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能夠有效中和與清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，避免其對細(xì)胞和組織的損傷?！H和DPPH·都是常見的活性氧自由基，在生理過程中，它們可能引起氧化應(yīng)激并導(dǎo)致細(xì)胞損傷和疾病發(fā)展。結(jié)果表明，該多酚提取液具有潛在的抗氧化和清除自由基的功效，可以作為天然抗氧化劑或食品添加劑使用，這一發(fā)現(xiàn)對于野山竹多酚的應(yīng)用具有重要的意義，并為進(jìn)一步研究其抗氧化性能提供了初步論證。

因為對野山竹的研究不多，所以野山竹的潛在成分和藥用價值沒有被完全開發(fā)，導(dǎo)致野山竹殼等副產(chǎn)物被大量浪費(fèi)，因此野山竹殼在食品領(lǐng)域的應(yīng)用具有廣闊的前景。通過合理的開發(fā)利用，其中的活性成分可為食品增添營養(yǎng)，改善質(zhì)地，并生產(chǎn)具有抗氧化、抗衰老和增強(qiáng)免疫力等功效的功能性食品，需要進(jìn)一步的研究和開發(fā)來推動其應(yīng)用。

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