三黃四物湯不同溶劑提取物的抗炎作用研究

〔摘要〕 目的 探索三黃四物湯（SST）不同溶劑提取物的體外抗炎作用及其相關(guān)機(jī)制，分析其主要成分與抗炎作用的關(guān)系，并探索其體內(nèi)抗炎作用。方法 通過制備三黃四物湯水提物（SSTW）及乙醇提取物（95%乙醇提取物SSTE、50%乙醇提取物SSTWE）；采用高效液相色譜法（HPLC）分析其主要成分；通過LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型，并采用苯酚膠漿法建立大鼠慢性盆腔炎（chronic pelvic inflammatory disease， CPID）模型；使用MTT法檢測細(xì)胞存活率，Griess法檢測NO水平，ELISA法檢測PGE2、IL-6、TNF-α水平，Western blot法檢測COX-2、iNOS及MAPKs通路、NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平，并通過病理切片觀察大鼠子宮病理改變。結(jié)果 SSTWE 0.78-25 μg/mL組與正常組相比，細(xì)胞存活率無顯著差異（Pgt;0.05）。SSTWE 12.5 μg/mL抗炎作用弱于SSTE而類似于SSTW，SSTWE 25 μg/mL抗炎作用強(qiáng)于SSTW而類似于SSTE。SSTW、SSTE和SSTWE均明顯降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白表達(dá)（Plt;0.05）；SSTWE明顯降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞ERK磷酸化蛋白表達(dá)、IκB-α磷酸化蛋白表達(dá)及細(xì)胞核中p65蛋白表達(dá)，同時增加IκB-α總蛋白表達(dá)及細(xì)胞質(zhì)中p65蛋白的表達(dá)水平（Plt;0.05）。SST明顯抑制CPID大鼠血清TNF-α和IL-6含量（Plt;0.05），減輕盆腔局部組織粘連，改善子宮病理形態(tài)。結(jié)論 三黃四物湯有顯著體外抗炎作用，其機(jī)制均與炎癥通路MAPKs和NF-κB有關(guān)；其不同提取物抗炎作用及細(xì)胞毒性不同，可能與當(dāng)歸成分有關(guān)；SST對大鼠CPID有顯著抗炎作用，可作為慢性盆腔炎的候選藥物。

〔關(guān)鍵詞〕 三黃四物湯；炎癥；慢性盆腔炎；信號通路；提取物

〔中圖分類號〕R285.5" " nbsp; " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.11.012

Anti-inflammatory effects of extracts from Sanhuang-Siwu-Tang in different solvents

LI Jing*， YU Tao， QI Yaoqun， ZHANG Xiaorong， JI Jiahui， LI Hanchao

Affiliated Hospital of Jiujiang University， Jiujiang， Jiangxi 332000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the in vitro anti-inflammatory effects and related mechanisms of different solvent extracts of Sanhuang-Siwu-Tang （SST）， analyze the relationship between its main components and anti-inflammatory effects， and investigate its in vivo anti-inflammatory effects. Methods SST water extract （SSTW）， as well as 95% ethanol extract （SSTE） and 50% ethanol extract （SSTWE） were prepared. High-Performance Liquid Chromatography （HPLC） was used to analyze the main components. An inflammatory model was established by inducing RAW264.7 cells with LPS， and a rat model of chronic pelvic inflammatory disease （CPID） was established by phenol mucilage method. Cell viability was determined by MTT; NO level was measured by Griess; PGE2， IL-6， and TNF-α levels were examined by ELISA; COX-2， iNOS， MAPKs， and NF-κB protein expressions were measured by Western blot; pathological changes in the rat uterus were observed through pathological sections. Results There was no significant difference in cell viability between the SSTWE groups at various concentrations from 0.78 to 25 μg/mL and normal group （Pgt;0.05）. The anti-inflammatory effects of SSTWE at 12.5 μg/mL were weaker than those of SSTE but similar to those of SSTW， while the anti-inflam？鄄matory effects of SSTWE at 25 μg/mL were stronger than those of SSTW but similar to those of SSTE. SSTW， SSTE， and SSTWE all significantly reduced iNOS and COX-2 protein expressions in LPS-induced RAW264.7 cells （Plt;0.05）. SSTWE significantly reduced the protein expressions of p-ERK， p-IκB-α， and nuclear p65 in LPS-induced RAW264.7 cells， while increasing IκB-α total protein expression and cytosolic p65 protein expression （Plt;0.05）. SST significantly lowered serum TNF-α and IL-6 levels in CPID rats （Plt;0.05）， reduced local pelvic tissue adhesion， and improved pathological morphology of the uterus. Conclusion SST has significant in vitro anti-inflammatory effects， and its mechanisms are related to the inflammatory pathways of MAPKs and NF-κB. Its different extracts have varying anti-inflammatory effects and cytotoxicity， possibly related to the components of Danggui （Radix Angelicae Sinensis）. Moreover， SST has significant anti-inflammatory effects on CPID in rats and can be considered as a candidate drug for CPID.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Sanhuang-Siwu-Tang; inflammation; chronic pelvic inflammatory disease; signaling pathway; extract

三黃四物湯（Sanhuang-Siwu-Tang，SST）由當(dāng)歸、川芎、白芍、地黃、黃芩、黃連和大黃7種藥物組成，主要用于治療熱盛、經(jīng)前吐衄等婦科疾病[1]。前期研究表明，SST具有較好的體外抗炎活性，并與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-kappaB）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)[2]。放結(jié)合SST對婦科疾病治療作用，開展SST對婦科炎性疾病的研究。慢性盆腔炎（chronic pelvic inflammatory disease，CPID）是婦科常見疾病，主要表現(xiàn)為女性盆腔生殖器官、周圍結(jié)締組織和盆腔腹膜的慢性炎癥，其發(fā)病率高、病程長，嚴(yán)重影響了育齡婦女生殖健康和生活質(zhì)量[3]。CPID常見證為“濕熱瘀結(jié)證”，中醫(yī)治法為清熱除濕、活血化瘀，恰與SST的功效相一致。因此，本研究旨在評估SST的不同提取物體外抗炎作用及機(jī)制，分析其主要成分與抗炎作用的關(guān)系，并進(jìn)一步探索SST對CPID大鼠的抗炎作用。

1 材料

1.1" 藥材、動物、細(xì)胞來源

藥材：當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃、黃芩、黃連、大黃（由于實驗前期在韓國圓光大學(xué)進(jìn)行，因此實驗所用中藥材均購自韓國，均由圓光大學(xué)Jang Kyukwan教授鑒定）；RAW264.7細(xì)胞（韓國圓光大學(xué)藥學(xué)院）；動物：SPF級SD大鼠（購自江西中醫(yī)藥大學(xué)，許可證編號：SCXK贛12018-0003）。

1.2" 試劑

黃芩苷（純度≥98.0%，Wako Pure Chemical Industries， Ltd.）；小檗堿、黃芩素、漢黃芩素（純度≥ 98.0%，北京盛世康普化工技術(shù)研究院）；ELISA試劑盒（美國R amp; D systems公司）；Nuclear extraction試劑 盒（美國Cayman Chemical公司）；iNOS、COX-2、MAPK（P-ERK、P-p38、P-JNK、ERK、P-38、JNK）、NF-κB（p65、p-IκB-α、IκB-α）抗體以及PCNA、anti-actin（美國Cell signaling Tecnology公司）；二抗（德國Santa Cruz Biotechnology公司）；MTT（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，U.S.A.）。HPLC用水和乙腈均為色譜純（美國J.T.Baker公司），其他試劑為分析純（日本Tokyo公司）；RPMI Medium 1640 and小牛血清（美國Gibco BRL Co.公司）；液化苯酚、黃耆樹膠粉（上海麥克林生化科技股份有限公司）；甘油（國藥控股星鯊制藥有限公司）；婦科千金片（株洲千金藥業(yè)股份有限公司）。

2 方法

2.1" 提取物的制備

取干燥藥材，SST復(fù)方（當(dāng)歸10 g，川芎10 g，白芍15 g，熟地黃10 g，黃芩10 g，黃連10 g，大黃10 g），500 mL溶劑回流提取2.5 h，共2次，合并提取液并濃縮，得總浸膏。SST水提取物（SSTW）、95%乙醇提取物（SSTE）、50%乙醇提取物（SSTWE），得率分別為38.85%、33.64%、42.67%。

2.2" HPLC圖譜分析

2.2.1" 儀器及軟件" YL9100 HPLC系統(tǒng)（Young In Chromass Co. Korea）：YL9101真空脫氣機(jī)，YL9110高壓輸液泵，YL9160 PDA檢測器。分析軟件：YLClarity" （Young Lin Instriments Co. Inc. Version 4.0.3.876）。

2.2.2" 色譜條件" 色譜柱：Phenomenex Gemini NXC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）。梯度洗脫程序（B%）：0～20 min，5%～25% B；20～30 min，25% B；30～45 min，25%～45% B；45～50 min，45%～100% B；50～60 min，100% B。樣品質(zhì)量濃度：10 mg/mL；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.7 mL/min；檢測波長：280 nm。

2.2.3" 相對含量計算" 相對含量的計算基于HPLC檢測中各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為0.1～ 100 μg/mL，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999。計算公式：相對含量=（樣品峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

2.2.4" 精密度試驗" 各樣品分別在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.2.5" 穩(wěn)定性試驗" 各提取物分別在上述色譜條件下分別于0、2、4、6、8、12、24、32、48 h進(jìn)樣，測各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6" 重復(fù)性試驗" 每個提取物平行制備5份，分別在上述色譜條件下測得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3" 細(xì)胞實驗

2.3.1" MTT法檢測細(xì)胞存活率" RAW264.7細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下，使用含10%胎牛血清的RMPI培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為1×104，每組6孔，細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的SST提取物，對照組加入等體積RMPI培養(yǎng)基，孵育 24 h。加入終質(zhì)量濃度0.5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，吸除上清液，每孔加入150 μL DMSO，完全溶解后于540 nm處檢測吸光度值。計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。

2.3.2" ELISA檢測細(xì)胞上清液NO及PGE2、IL-6、TNF-α水平" 細(xì)胞懸液調(diào)整至1×106/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每組3孔，細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的SST提取物，對照組加入等體積RMPI培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后加入LPS（終濃度1 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集上清液，用Griess法檢測NO濃度，用ELISA試劑盒檢測PGE2、IL-6、TNF-α水平。

2.3.3" Western blot檢測細(xì)胞中iNOS、COX-2、MAPKs、NF-κB蛋白" 細(xì)胞懸液調(diào)整至1×106/mL，接種于6孔培養(yǎng)板。細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的SST提取物，對照組加入等體積RMPI培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h后加入LPS（終濃度1 μg/mL）。（1）COX-2、iNOS蛋白提?。豪^續(xù)培養(yǎng)18 h后提取COX-2、iNOS蛋白，提取液為細(xì)胞裂解液；（2）MAPK蛋白提取：繼續(xù)培養(yǎng)1 h后提取MAPK蛋白，蛋白提取液為裂解液與蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合液比率為100∶3；（3）NF-κB蛋白提取：細(xì)胞培養(yǎng)1.5 h后提取NF-κB蛋白，使用Nuclearextraction試劑盒，方法參照產(chǎn)品說明書。提取蛋白后，每個樣品30 μg蛋白上樣，用7.5%～12% SDS-PAGE濃縮膠及分離膠進(jìn)行120 V垂直電泳及45 V轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，于4 ℃條件下與一抗溶液孵育過夜，于室溫條件下與二抗溶液孵育1 h，每個步驟用含0.05% Tween-20 TBS溶液洗滌，最后ECL顯色。

2.3.4" 綜合評估SSTWE的相對抗炎作用" 為綜合評估SSTWE相對于SSTW及SSTE的抗炎作用，我們采用評分表，標(biāo)準(zhǔn)如下：若SSTWE顯著弱于SSTW或SSTE（Plt;0.05），得分為-1；若SSTWE顯著強(qiáng)于SSTW或SSTE（Plt;0.05），得分為1；若SSTWE與SSTW或SSTE無明顯差異（Pgt;0.05），得分為0。

2.4" 動物實驗

2.4.1" 實驗動物及分組" 選用20只雌性未孕SPF級SD大鼠，體質(zhì)量（200±20） g，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性對照組和SST組，每組5只。

2.4.2" 苯酚膠漿法造模[4]" 造模前12 h禁食不禁水，麻醉后在大鼠下腹正中切開2 cm暴露子宮，向左側(cè)宮腔緩慢注射0.02 mL 25%苯酚膠漿，關(guān)腹消毒后放入鼠籠復(fù)蘇。

2.4.3" 藥物干預(yù)" 造模第11天開始每天中午灌胃給藥，持續(xù)14 d。陽性對照組給予婦科千金片（2片/kg），SST組給予SSTWE（7.8 g/kg），其余組大鼠灌胃生理鹽水。

2.4.4" 指標(biāo)檢測

（1）一般情況觀察" 觀察大鼠精神狀態(tài)、飲食、排便及活動情況，記錄手術(shù)切口感染及死亡情況。

（2）標(biāo)本采集" 末次灌胃后禁食12 h，麻醉后腹主動脈采血，3 000 r/min離心20 min，取上清液保存?zhèn)溆谩ｉ_腹取左側(cè)子宮組織，用4%多聚甲醛固定。

（3）子宮組織學(xué)觀察" 肉眼觀察子宮形態(tài)及質(zhì)地，記錄有無粘連、積液。取子宮組織固定后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片HE染色，光鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化。

（4）大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-α水平檢測

使用ELISA試劑盒檢測大鼠血清中IL-6和TNF-α水平，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5" 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示，應(yīng)用Graphpad統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" HPLC譜圖

各提取物按2.2.2色譜條件測定結(jié)果，詳見圖1、表1。

3.2" SST對RAW264.7細(xì)胞抗炎活性作用

3.2.1" SST對RAW264.7細(xì)胞生存率的影響" 干預(yù)組分別給予SSTWE 0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL。SSTWE 0.78～25 μg/mL組與正常組相比，細(xì)胞存活率無顯著差異（Pgt;0.05）；50～200 μg/mL組與正常組相比，細(xì)胞存活率顯著下降（Plt;0.001）。詳見圖2。

3.2.2" SST對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO、PGE2、TNF-α、IL-6含量的影響" SSTWE 12.5 μg/mL對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中NO和PGE2的抑制作用弱于SSTW（Plt;0.05，Plt;0.001）和SSTE（Plt;0.001，Plt;0.001）；對TNF-α的抑制作用強(qiáng)于SSTW（Plt;0.001）但弱于SSTE（Plt;0.001），對IL-6的抑制作用強(qiáng)于SSTW（Plt;0.01）但相似于SSTE（Pgt;0.05）。SSTWE 25 μg/mL對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中NO的抑制作用強(qiáng)于SSTW（Plt;0.001）但弱于SSTE（Plt;0.001）；對PGE2的抑制作用與SSTW相似（Plt;0.001）但弱于SSTE（Plt;0.001），對TNF-α和IL-6的抑制作用強(qiáng)于SSTW（Plt;0.001，Plt;0.001）和SSTE（Plt;0.001，Plt;0.05）（圖3）。評分表結(jié)果顯示，SSTWE 12.5 μg/mL相對于SSTW為0分，相對于SSTE為-3分；SSTWE 25 μg/mL相對于SSTW為3分，相對于SSTE為0分。詳見表2。

3.2.3" SST對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中iNOS和COX-2蛋白表達(dá)的影響" 干預(yù)組分別給予SSTW 50 μg/mL，SSTE 12.5 μg/mL，SSTWE 12.5和25 μg/mL。LPS誘導(dǎo)后，細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白表達(dá)均明顯增高（Plt;0.05）；與LPS組相比，SSTW、SSTE和SSTWE各組iNOS和COX-2蛋白表達(dá)均明顯降低（Plt;0.05）。詳見圖4。

3.2.4" SST對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞MAPKs蛋白表達(dá)的影響" LPS誘導(dǎo)后，細(xì)胞ERK、JNK、p38磷酸化蛋白表達(dá)均明顯增高（Plt;0.05）；與LPS組相比，SSTWE組ERK磷酸化蛋白表達(dá)明顯降低（Plt;0.05），p38和JNK磷酸化蛋白表達(dá)無明顯差異（Pgt;0.05）。詳見圖5。

3.2.5" SST對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NF-κB信號通路蛋白表達(dá)的影響" LPS誘導(dǎo)后細(xì)胞IκB-α磷酸化蛋白表達(dá)及降解均顯著增加（Plt;0.05），細(xì)胞核中p65蛋白表達(dá)顯著增加（Plt;0.05），細(xì)胞質(zhì)中的p65蛋白表達(dá)顯著降低（Plt;0.05）。與LPS組相比，SSTWE組明顯降低IκB-α磷酸化蛋白表達(dá)（Plt;0.05）及細(xì)胞核中p65蛋白表達(dá)（Plt;0.05），同時增加IκB-α總蛋白表達(dá)（Plt;0.05）及細(xì)胞質(zhì)中p65蛋白的表達(dá)水平（Plt;0.05）。詳見圖6。

3.3" SST對CPID大鼠抗炎作用

3.3.1" 一般情況觀察" 整個實驗周期正常組大鼠精神狀態(tài)良好，活動、飲食、二便均正常，體質(zhì)量正常增長；造模組大鼠所有大鼠術(shù)后手術(shù)切口未見感染，無一意外死亡，稍有不安情緒，飲食、二便稍有減少，體質(zhì)量較正常組大鼠減輕。

3.3.2" SST對CPID大鼠子宮組織的影響" 正常組：肉眼觀察子宮形態(tài)外觀基本正常，子宮質(zhì)地柔軟，盆腔臟器與結(jié)締組織無粘連；光鏡下觀察子宮壁組織結(jié)構(gòu)清晰，各層分界明顯，子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞排列整齊，平滑肌組織內(nèi)各層血管無充血水腫，無炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織無明顯增生、粘連，間質(zhì)無充血、水腫。模型組：肉眼觀察子宮有不同程度的腫脹變形，質(zhì)地變硬，盆腔臟器與結(jié)締組織明顯粘連；光鏡下觀察子宮壁組織結(jié)構(gòu)不清晰，各層分界不明顯，子宮內(nèi)膜組織缺失，上皮細(xì)胞排列變性、壞死、脫落，可見炎性細(xì)胞浸潤，子宮平滑肌纖維組織明顯增生、粘連，間質(zhì)充血、水腫。陽性對照組：肉眼觀察子宮形態(tài)大致正常，質(zhì)地較柔軟，盆腔臟器與結(jié)締組織稍有粘連；光鏡下觀察子宮壁組織結(jié)構(gòu)基本清晰，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞基本完整，排列基本規(guī)則，偶可見少許變性、壞死、脫落，少許炎性細(xì)胞浸潤，子宮平滑肌纖維組織無明顯增生、粘連。SST組：肉眼觀察子宮形態(tài)大致正常，可見輕度腫脹及充血，質(zhì)地較柔軟，盆腔臟器與結(jié)締組織稍有粘連；光鏡下觀察子宮壁組織結(jié)構(gòu)基本清晰，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞欠完整，排列欠規(guī)則，部分可見少許變性、壞死、脫落，少許炎性細(xì)胞浸潤，子宮平滑肌纖維組織稍見增生、粘連。詳見圖7。

3.3.3" SST對CPID大鼠血清TNF-α、IL-6含量的影響" 模型組大鼠血清TNF-α和IL-6含量較正常組均顯著增加（Plt;0.05），SST組和陽性對照組血清TNF-α和IL-6含量較模型組均顯著降低（Plt;0.05）。詳見圖8。

4 討論

本研究對SST的抗炎作用進(jìn)行了探索，揭示了SST在抑制炎癥反應(yīng)中的作用及其潛在機(jī)制。體外細(xì)胞實驗以LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型，評估SST對炎癥因子（NO、PGE2、IL-6、TNF-α）釋放以及炎癥相關(guān)蛋白（iNOS、COX-2、MAPK、NF-κB）表達(dá)的影響，體內(nèi)實驗通過苯酚膠漿法建立大鼠慢性盆腔炎模型，觀察提取物對整體炎癥反應(yīng)的調(diào)控效果，包括對大鼠子宮組織學(xué)變化和血清炎癥因子水平的影響。

RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞常用作為體外炎癥模型，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后產(chǎn)生大量炎性因子如NO、iNOS、PGE2、COX-2、ILs、TNF-α等，從而引起炎癥反應(yīng)和組織損傷[5-6]。本研究顯示，SST的3種不同提取物（SSTW、SSTE、SSTWE）在體外均能顯著抑制炎性因子的釋放，降低iNOS和COX-2等炎癥蛋白的表達(dá)。評分表結(jié)果表明，SSTWE 12.5 μg/mL抗炎作用弱于SSTE而與SSTW相似，SSTWE 25 μg/mL抗炎作用強(qiáng)于SSTW而與SSTE相似，故SSTWE的抗炎作用介于SSTW和SSTE之間。細(xì)胞生存率結(jié)果表明，SSTW 100～200 μg/mL[1]、SSTE 25～200 μg/mL[1]、SSTWE 50～200 μg/mL范圍內(nèi)對細(xì)胞存活率有顯著影響。因此，SSTWE的細(xì)胞毒性與抗炎作用均介于SSTW和SSTE之間，表現(xiàn)出較優(yōu)的整體特性。LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后激活MAPK和NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7]。MAPK信號通路主要由ERK、p38和JNK組成，這些蛋白在炎癥刺激下被磷酸化，從而激活下游的炎癥反應(yīng)。NF-κB在炎癥及免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，被激活后細(xì)胞質(zhì)中IκB-α磷酸化并降解，p65蛋白則進(jìn)入細(xì)胞核中與DNA結(jié)合，從而促進(jìn)炎癥因子的大量表達(dá)[7-9]。前期研究表明，SSTW可顯著降低ERK磷酸化蛋白表達(dá)，SSTE可顯著降低p38和ERK磷酸化蛋白表達(dá)[1]。本研究表明，SSTWE可顯著降低ERK磷酸化蛋白表達(dá)。綜合表明，SSTW和SSTWE可通過ERK通路抑制炎癥反應(yīng)，而SSTE可通過p38和ERK通路抑制炎癥反應(yīng)。前期研究[1]及本研究表明，SST 3種提取物均減少IκB-α磷酸化使得IκB-α總蛋白表達(dá)增加，同時增加細(xì)胞質(zhì)p65蛋白表達(dá)、降低細(xì)胞核p65蛋白表達(dá)，表明3種提取物均可通過NF-κB通路抑制炎癥的發(fā)生。根據(jù)HPLC譜圖分析，SSTW的主要成分來自黃芩、黃連和白芍，SSTE和SSTWE的主要成分均來自黃芩、黃連和當(dāng)歸，后兩者當(dāng)歸含量遠(yuǎn)高于前者，與本研究發(fā)現(xiàn)SSTE和SSTWE抗炎作用及細(xì)胞毒性均強(qiáng)于SSTW相一致，提示抗炎作用可能與當(dāng)歸含量有較大關(guān)聯(lián)。

結(jié)合SST對婦科疾病治療作用，本研究開展SST對婦科炎性疾病的研究。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，CPID常見證為“濕熱瘀結(jié)證”，治法為清熱除濕、活血化瘀，恰與SST的功效相一致。因此，本研究探索SST對CPID大鼠的抗炎作用。CPID是一種常見的婦科炎性疾病，其臨床表現(xiàn)主要包括盆腔局部的炎性滲出、粘連和增生，并伴隨異常的細(xì)胞因子表達(dá)[10]。傳統(tǒng)的抗生素治療由于耐藥性和副作用等問題，仍存在很多弊端。然而，中藥以復(fù)方用藥為主，其多成分、多途徑、多靶點作用，以及毒副作用低等特點，顯示出獨特的優(yōu)勢[11]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，免疫因素是引起CPID的關(guān)鍵因素[12-13]，其組織粘連、增生纖維化等病理損傷與細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等的異常表達(dá)相關(guān)[14-15]。本研究顯示，SST組大鼠子宮組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)和血清TNF-α、IL-6含量均較模型組有顯著改善，表明SST可通過抑制炎癥因子、減輕盆腔局部組織粘連、改善子宮病理形態(tài)等，最終對CPID發(fā)揮治療作用。

5 結(jié)論

綜上所述，三黃四物湯有顯著抗炎作用，其機(jī)制與炎癥通路MAPKs和NF-κB有關(guān)；其不同提取物抗炎作用及細(xì)胞毒性不同，可能與當(dāng)歸含量有較大關(guān)聯(lián)，提示在實際應(yīng)用中，可通過改變煎煮方法取得更好的臨床療效；同時，其對慢性盆腔炎大鼠有顯著抗炎作用，從而為今后臨床應(yīng)用及進(jìn)一步研究墊定了基礎(chǔ)。

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